[發明專利]竹節參EST-SSR引物組的開發及其在遺傳多樣性等方面的應用

有效

• 申請號: 202010832171.6
• 申請日: 2020-08-18
• 公開（公告）號: CN112080574B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 付濤;胡仲義;吳立威;易官美;陳際伸;劉峰;王志龍
• 申請（專利權）人: 寧波城市職業技術學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11;G16B20/30;G16B25/20;G06K9/62
• 代理公司: 天津鉑茂專利代理事務所(普通合伙) 12241
• 代理人: 張天翔

本發明公開了竹節參EST?SSR引物組的開發及其在竹節參遺傳多樣性中的應用，其應用操作方法步驟如下：S1：材料選擇；S2：儀器和試劑選擇；S3：DNA提??；S4：進行EST?SSR引物合成；步驟一：序列來源；步驟二：EST?SSR位點查找；步驟三：EST?SSR引物設計；步驟四：EST?SSR引物篩選；步驟五：聚丙烯酰氨凝膠電泳；在最適退火溫度下，對有目標條帶的引物用于15份不同產地竹節參材料進行PCR擴增；S5：數據處理；SSR結果分析可知，貴州和云南產地竹節參親緣關系較近，與四川產地竹節參親緣關系相對較遠，此外，由于不同產地竹節參基本可以彼此單獨聚類在一起，因此，本應用可以很好地運用到竹節參的遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建以及竹節參道地性的分子鑒定等方面。

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，具體是一種竹節參EST-SSR引物組的開發及其在 遺傳多樣性等方面的應用。

背景技術

竹節參(Panax japonicus C.A.Mey.)又名竹節三七、竹節人參、白三七等， 為五加科人參屬多年生植物，主要分布于陜西、甘肅、安徽、浙江、江西、福建、 河南、湖南、湖北、廣西、西藏等地，兼具北藥人參和南藥三七的功效，既補氣 又補血，被民間譽為“草藥之王”，以根莖入藥，具有散瘀止血，消腫止痛，祛 痰止咳，補虛強壯的功效，提高機體免疫力，延緩衰老，并具有護肝、抗炎、抗 疲勞、抗腫瘤等療效。

竹節參主要含有豐富的皂苷類成分，如人參皂苷、竹節參皂苷、偽人參皂苷、 竹節人參皂苷甲酯、珠子參苷等。其中皂苷類成分主要為齊墩果烷型三萜皂苷， 如人參皂苷有Rg1、Re、Rg2、Rb1、Rb2、Rd等；竹節參皂苷有Ⅳ、竹節參皂苷 Ⅳa、竹節參皂苷Ⅴ、竹節參皂苷Ⅴ甲酯、Pjs-1、Pjs-2等；偽人參皂甙有F11， 除此之外，還含有豐富的竹節參多糖、氨基酸，少量的揮發油及無機元素等成分。 由于諸多因素，野生竹節參的資源逐年減少，目前已處于瀕危狀態，目前只有湖 北恩施及周邊有栽培。

SSR標記是近幾年來發展起來的建立在PCR基礎上的第2代分子標記，具有 多態性高、重復性好、共顯性遺傳、技術簡單、特異性強等優點。其具有RFLP 的所有遺傳學優點，且避免了RFLP技術中使用放射性同位素的缺點，又比RAPD 的重復性和穩定性高，因而目前已成為遺傳標記中的熱點。目前，SSR分子標記 廣泛應用于中藥材的遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建和分子鑒定等，如周榮榮等 開發出5對多態性較強、擴增帶型穩定的SSR引物，對江西產區9個不同粉葛 栽培種進行遺傳多樣性分析，為江西粉葛種質建立了DNA身份證，為粉葛的優 良種質選育提供參考信息，為中藥材道地性研究提供理論依據。蔣超等開發出13對EST-SSR引物在52份金銀花類藥用植物中具有有效擴增產物,且引物 jp.ssr4、jp.ssr64及jp.ssr65可用于忍冬及其變種、山銀花原植物的鑒別。 郝廣婧等開發出了一批為黑果枸杞SSR引物，可用于品種鑒定、遺傳多樣性及 分子標記輔助育種等方面。在竹節參分子研究方面，程揚等開發了30對SSR 引物，多態性較好，表明SSR分子標記可用于竹節參的品種鑒定；陳鏡安等利用 ITS2用于鑒定竹節參及其近緣物種和混偽品；Amit等對竹節參進行了RNA-seq 轉錄組分析，并與其它人參屬植物比較，鑒定出潛在的皂苷生物合成有關的基因。

目前開發EST-SSR引物用于竹節參遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建的文章還 少見于報道，本研究通過開發EST-SSRSSR引物對我國不同產地竹節參的遺傳多 樣性和指紋圖譜的構建進行相關研究，這對竹節參野生資源的保護具有重要意義， 也可為竹節參育種和遺傳改良奠定基礎；其次，構建不同產地竹節參的指紋圖譜 (尤其是道地性藥材)，為道地性竹節參真偽鑒別提供分子依據。

發明內容

本發明的目的在于提供竹節參EST-SSR引物組的開發及其在遺傳多樣性等 方面的應用，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：