[發明專利]非診斷目的基于CRISPR/Cas技術超靈敏檢測miRNA的方法

有效

• 申請號: 202010831720.8
• 申請日: 2020-08-18
• 公開（公告）號: CN112301116B
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 宮曉群;羅冉;常津;陳明慧
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 楊歡

本發明公開了一種非診斷目的基于CRISPR/Cas技術超靈敏檢測miRNA的方法，其包括：莖環DNA鏈的設計、klenow酶擴增、Cas12a的特異性切割，其中莖環DNA鏈的設計包含在已知miRNA序列的基礎上設計長度及結構不同的DNA鏈和長度及結合力不同的引物序列，以更顯著的檢測到目標miRNA，klenow酶擴增和Cas12a的特異性切割實驗從而提升了檢測miRNA的速度和靈敏度。本發明能快速靈敏的檢測miRNA的含量，在生物醫學研究和臨床診斷中具有很大應用價值。

技術領域

本發明屬于miRNA檢測領域，具體涉及一種非診斷目的基于CRISPR/Cas技術超靈敏檢測miRNA的方法。

背景技術

微小RNA(miRNA)是廣泛存在于真核生物當中的一類長度為18-25個成熟核苷酸(nt)組成的內源性小分子非編碼RNA，由DNA轉錄產生，pre-miRNA(precursor?microRNA)剪切而來。通過堿基互補配對與其靶基因的mRNA?3′非編碼區特異性結合，抑制靶基因表達并參與多種生物過程，包括細胞的增殖、凋亡、自噬、分化和轉移。每個miRNA可以調節多個基因靶標，有多功能調節作用，而幾個不同的miRNA也可以靶向作用于相同的信使RNA(mRNA)共同發揮作用。近期研究表明，miRNA在一系列的生命活動過程中具有不可替代的作用，如當機體內的某些miRNA表達發生變化時,更易罹患癌癥和其他一系列疾病。這一現象提示,人們可通過對miRNA的檢測來實現對相關疾病的早期診斷。

Klenow酶是大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段，缺失5'-3'外切酶活性而保留了DNA聚合酶Ⅰ的5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切酶活性。Klenow酶的蛋白質晶體學研究發現,它包含兩個不同的結構域,小結構域可以結合dNMP和二價金屬離子,含有3'-5'外切酶活性中心,而C末端的大結構域中有一個可以結合雙鏈DNA的“裂口”,被認為含有聚合酶活性中心。Klenow酶在分子生物學領域應用廣泛,如粘性末端補齊、cDNA第二鏈合成、DNA的3'末端標記及焦磷酸測序等。Klenow是焦磷酸測序中使用最廣泛的DNA聚合酶，但天然的Klenow由于其3'外切酶活性會對引物進行切割產生測序信號的混亂而無法直接用于測序反應，需對其進行改造使外切酶活性缺失才能保證測序的準確性。Klenow(3′→5′exo-)屬于中溫DNA聚合酶(mesophilic?DNA?polymerase)，該酶缺乏校正核酸酶活性(3′→5′)和缺口平移核酸酶活性(5′→3′)，在DNA合成過程中，它顯示出中鏈置換活性。

CRISPR/Cas的基因座結構相對簡單，一個典型的CRISPR/Cas基因座由一個編碼Cas蛋白的操縱子和一個重復間隔序列(CRISPR)組成。位于CRISPR基因座5′端成簇的Cas基因，這些Cas基因是CRISPR免疫防御途徑中的基本組成成分，編碼的蛋白具有核酸酶相關的功能結構域，Cas蛋白通過位點特異性的切割將入侵DNA切斷。Cas12a屬于2類V型CRISPR效應蛋白，是在單鏈向導RNA引導下與靶DNA特定位點結合并切割的核酸內切酶。研究表明，CRISPR/Cas12a不僅對DNA具有活性，而且對RNA同樣有較高的活性。Cas12a與成熟crRNA形成Cas12a-crRNA核糖核蛋白二元復合體，即可實現對靶基因的識別和剪切。

基于上述原因，本發明擬結合使用PCR技術和堿基互補配對原則，使用CRISPR/Cas技術特異性識別擴增得到的互補DNA序列，激活Cas12a的酶活性，采用對于自主加入BHQ-TTTTTTTTTT-Cy5序列的切割及熒光信號的檢測，實現信號的級聯放大效應，從而實現使用CRISPR/Cas技術超靈敏檢測miRNA。

發明內容

本發明的目的在于提供一種非診斷目的基于CRISPR/Cas技術超靈敏檢測miRNA的方法。

本發明為實現上述目的，采用以下技術方案：

1.一種非診斷目的基于CRISPR/Cas技術超靈敏檢測miRNA的方法，其特征在于，包括下述步驟：