[發明專利]一種檢測腐敗梭菌的膠體金試紙條及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202010830760.0
• 申請日: 2020-08-18
• 公開（公告）號: CN111948388B
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發明（設計）人: 柴同杰;龍憲榮;翁鴻宇
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 薛鵬喜

1.一種檢測腐敗梭菌的膠體金試紙條，其特征在于，所述膠體金試紙條包括：PVC底板、樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙；

將所述硝酸纖維素膜粘結在所述PVC底板的中部；將結合墊和吸水紙分別粘貼在所述硝酸纖維素膜的前、后兩端，在所述樣品墊的正上方設有樣品孔；

所述硝酸纖維素膜上自靠近結合墊端依次設有檢測線、質控線，所述檢測線上包被有腐敗梭菌多克隆抗體；所述質控線上固載有羊抗兔IgG抗體；

所述樣品墊與結合墊的前端搭接；所述結合墊的后端與所述硝酸纖維素膜的前端搭接；所述吸水紙與硝酸纖維素膜的后端搭接，所述搭接的覆蓋部分寬度為1-2mm；

該檢測腐敗梭菌的膠體金試紙條的制備方法，包括步驟：

（1）腐敗梭菌抗體的制備：

甲醛滅活后的腐敗梭菌菌體蛋白作為抗原，將抗原與弗氏佐劑混合后，免疫日本大耳白兔，取四免后的血清，采用親和層析柱進行親和純化，制成腐敗梭菌多克隆抗體；所述腐敗梭菌多克隆抗體的效價為1:1024000；

（2）膠體金標記抗體的制備：

1) 膠體金溶液的制備：按檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，將98mL雙蒸水加熱至65℃，磁力攪拌下準確加入新鮮制備的質量分數為1%的氯金酸水溶液1mL，繼續加熱至95℃，迅速加入質量分數為1%的檸檬酸三鈉水溶液1mL，不斷攪拌煮沸15min，待溶液顏色由黑—紫變淺酒紅色時，停止加熱，冷卻至室溫，獲得膠體金溶液；

2) 膠體金標記的最適pH確定：用0.2mol/L碳酸鉀溶液調節膠體金溶液的pH，通過膠體金梯度法確定抗體與膠體金結合的最適pH值為8.0；

3) 抗體最適標記量的確定：采用蛋白梯度法確定腐敗梭菌抗體穩定1ml膠體金所需的最小抗體量為10μg/ml，實際膠體金探針制備工作中，加入的抗體量為最小蛋白量的120%-130%，最終抗體濃度為12μg/ml-13μg/ml；

4) 膠體金-抗體結合物原液的制備和純化：將最適pH膠體金溶液20ml加入腐敗梭菌抗體中，使抗體濃度為12μg/ml-13μg/ml，并在室溫下攪拌30min，制得膠體金-抗體結合物溶液；將10%BSA 2ml加入制得的終濃度0.4%的膠體金-抗體結合物溶液中，室溫攪拌10min，或者加入10%聚乙二醇0.2ml，室溫攪拌10min，9000-11000r/min離心40-60min，棄去上清，沉淀溶于2ml膠體金-抗體保存液中，用0.45μm濾膜過濾，所得即為膠體金-抗體結合物原液；在1ml膠體金-抗體結合物原液中加入10%NaCl水溶液1ml后，溶液仍為無沉淀的紫紅色液體，說明制得的膠體金-抗體結合物原液具有良好的穩定性；

5) 膠體金-抗體結合物原液工作濃度的確定：膠體金-抗體結合物原液經二倍倍比稀釋試驗測試，結果顯示當膠體金-抗體結合物原液的工作濃度為1:4時，檢測效果最佳；

（3）結合墊的制備：

用工作液將膠體金-抗體結合物原液按體積比1:4進行稀釋，所述工作液為100ml體系：Tris-HCl 1.2114g，Triton X-100 1ml，氯化鈉0.5884g，2g蔗糖，0.02%疊氮鈉，溶于100ml超純水中，調pH8.0；取1.4ml膠體金-抗體結合物稀釋液，均勻地加在玻璃纖維膜上，置37℃烤干，制成結合墊；

（4）設置檢測線和對照線的硝酸纖維素膜的制備：

1) NC膜型號的選擇：通過跑板功能測試、層析性能測試和重新選擇試驗，綜合評定后，NC膜型號為賽多利斯CN140；

2) 檢測線及質控線條件的建立和優化：將NC膜上T線及C線的包被抗體設置如下幾個濃度梯度：1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml，選擇顯色效果最優的一組作為腐敗梭菌抗體使用濃度和羊抗兔IgG抗體使用濃度；結果表明，檢測顯色效果最優的一組濃度：腐敗梭菌抗體工作濃度為1.5mg/ml，羊抗兔IgG抗體工作濃度為1mg/ml；

3) T線及C線的點膜：用0.01mol/L pH8.0的PBS 將腐敗梭菌抗體和羊抗兔IgG抗體分別稀釋至所需濃度，用劃膜機在NC膜上點膜；T線與C線的距離為0.5cm，參數均為1ul/cm，噴好的NC膜置37 -45℃烤干干燥8h以上；

（5）膠體金試紙條組裝：

將PVC底板切成寬2.8mm×長6cm的條；在PVC底板中間粘設置檢測線和質控線的硝酸纖維素膜，距離上段1.5cm；在PVC底板下端粘貼結合墊，并與硝酸纖維素膜重疊0.1cm，然后在下端粘貼1.7cm寬的樣品墊，樣品墊與結合墊重疊0.1-0.2cm；在PVC底板上端粘貼1.7cm寬的吸水紙，并與硝酸纖維素膜重疊0.1-0.2cm；切成2.8mm寬的檢測卡。