[發明專利]利用重組酶調控基因表達的方法

有效

• 申請號: 202010829296.3
• 申請日: 2020-08-18
• 公開（公告）號: CN111705072B
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 琚存祥;張明坤;趙靜
• 申請（專利權）人: 江蘇集萃藥康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 周文波

本發明公開了一種利用重組酶調控基因表達的方法，涉及基因工程技術領域。本發明公開的方法包括：往重組酶識別位點與目標基因的ATG序列之間的位置插入間隔序列；間隔序列為不能形成莖環結構的序列，且其長度不低于5bp，以及不含有ATG序列或其互補序列。該方法通過間隔序列的引入，有效地克服了因殘留的可形成莖環結構的重組酶識別位點導致的下游目標基因不表達的問題，為基因調控提供了一種新的策略。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體而言，涉及一種利用重組酶調控基因表達的方法。

背景技術

基因工程技術是基因功能研究不可或缺的技術手段，Rudolf Jaenisch于1974年創造了世界第一只轉基因動物（小鼠）。至今，基因工程技術已經歷了近50年的發展，科學家已經發展出許多基因調控策略，可以對基因表達進行各種精細的修飾和調控，但仍然有一部分調控策略在應用中遇到問題，需要更優的解決方案。

鑒于此，特提出本發明。

發明內容

對編碼基因進行表達調控，如根據需求關閉或開啟特定基因的表達，是研究基因功能的重要手段，這種調控通常需要借助位點特異性重組來實現。目前已經有多種由特定的重組酶與其特別序列可組成位點特異性重組系統，如來自P1噬菌體的Cre/loxP(Lakso,Sauer et al. 1992)、來自酵母的FLP/FRT(Zhu and Sadowski 1995)、來自λ噬菌體的Dre/rox(Anastassiadis, Fu et al. 2009)系統，這類系統可以在相應重組酶的催化下刪除兩個重組位點之間的序列，留下單一的重組位點。將這類重組位點放置在目的基因重要功能域的編碼基因片段兩側（通常是內含子中），即可通過表達重組酶特異地刪除兩個重組位點之間的基因片段而實現基因失活(Skarnes, Rosen et al. 2011)（條件型基因敲除）。利用條件型基因敲除技術，能夠實現目的基因在空間或時間上被誘導剔除。

另一種基因功能研究的需求是可誘導地表達特定基因，現有的方法是將上述重組位點放在被稱為“STOP”元件（一個或多個阻止基因表達的元件，例如PloyA）的兩側，并將這樣的STOP元件放置在啟動子與編碼序列之間時，基因的表達即被關閉。當重組酶存在時，催化刪除重組位點間的STOP，編碼基因就能開始表達（參考圖1）。

幾種常用的重組酶識別位點如loxP、FRT、rox和它們的突變體，均含有反向重復序列，當轉錄成RNA后，可以形成13-14bp的莖環結構（參考圖2）。

但是本發明的發明人的發現，loxP及其他類似的包含反向重復序列的元件添加在編碼序列及啟動子之間時，會抑制編碼蛋白的表達，并且越靠近翻譯起始位點ATG，抑制效應越強，當ATG直接與這類重組位點連接時，后續編碼基因不表達。

使用重組位點（如loxP、FRT或rox）調控基因表達時，添加在編碼基因上游的這一個重組位點會抑制該編碼基因的表達，在制作條件型轉基因模型時，部分使用loxP-STOP-loxP元件或其類似元件制備的模型不能正常表達下游基因。

基于此，本發明提供一種新的利用重組酶調控基因表達的方法，以克服上述技術問題。

本發明是這樣實現的：

本發明提供一種利用重組酶調控基因表達的方法，所述目標基因位于基因組或載體中，所述目標基因的上游具有調控序列，所述調控序列包括如下元件：兩個重組酶識別位點、以及位于兩個所述重組酶識別位點之間的用于阻礙（或阻止）所述目標基因表達的轉錄終止元件；所述重組酶識別位點是包含反向重復序列能夠形成莖環結構的重組酶識別位點；兩個所述重組酶識別位點中的位于下游的重組酶識別位點緊鄰所述目標基因的ATG序列，所述方法包括：往位于下游的重組酶識別位點與所述目標基因的ATG序列之間的位置插入間隔序列；所述間隔序列為不能形成莖環結構的序列，且其長度不低于5bp，以及不含有ATG序列或其互補序列。