[發明專利]一種氨解液及氨解方法

有效

• 申請號: 202010828506.7
• 申請日: 2020-08-18
• 公開（公告）號: CN111704644B
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發明（設計）人: 曹春艷;趙雙;靳開寶;紀磊;韓承昊;朱知浩
• 申請（專利權）人: 蘇州金唯智生物科技有限公司
• 主分類號: C07H21/04
• 分類號: C07H21/04
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發明提供了一種氨解液及氨解方法，所述氨解液包括胺、丁醇、氨基醇和堿性水溶液，所述氨解方法包括：（1）向裝有固相載體的固相合成柱中加入氨解液；（2）將所述固相合成柱置于裝有氨解緩沖液的密封容器內，并保持所述固相合成柱不接觸氨解緩沖液；（3）加熱所述密封容器，使固相載體處于氨解緩沖液的蒸汽氣氛中，隨后冷卻；（4）從所述密封容器中取出固相合成柱，用洗脫液處理固相合成柱中的固相載體，并收集流出液。本發明的氨解液配方溫和，氨解緩沖液不僅提供氨解氛圍，而且輔助氨解反應，氨解工藝不使用有毒氣體、安全性高、環境友好、不破壞引物結構，同時后處理步驟簡單，避免交叉污染，可以實現大規模工業化應用。

技術領域

本發明屬于核酸的合成技術領域，涉及一種氨解液及氨解方法。

背景技術

短鏈DNA又稱為寡核苷酸（Oligo），通常采用固相合成技術進行人工合成。固相合成以控制孔徑玻璃球（CPG）為固相載體，以亞磷酰胺為單體，按照3’-5’方向，經過脫保護、縮合、氧化和蓋帽四個反應的循環，將目標序列逐漸連接在固相載體上。固相合成方法的優勢在于：每一步反應都在固相載體上進行，反應結束后可以將未反應的原料通過抽濾的方式除去，后處理步驟簡單。因此，固相合成被廣泛應用于Oligo和多肽合成。在現在大部分的Oligo合成工藝中，亞磷酰胺單體的5’-OH被二甲氧基三苯基（DMT）基團保護，可以在2~3%CCl₃COOH/CH₂Cl₂溶液中被切除，稱為脫保護反應；脫保護后裸露出的自由羥基與亞磷酰胺發生親核取代反應，即縮合反應；縮合反應結束后，為避免未反應的羥基進入下一輪縮合，需要將未反應的自由羥基乙酰化，俗稱“蓋帽”；最后，由于亞磷酰胺非常不穩定，需要用氧化劑如碘液將亞磷酰胺氧化為+5價磷。每連接一個堿基都需要經歷四個反應，將目標堿基全部合成后，將Oligo從CPG上剪切下來。同時，由于A、C、G堿基含有活性氨基，會干擾縮合反應，所以一般預先采用乙酰基（Ac）、苯甲酰基（Bz）和二氮甲基甲脒基（dmf）將氨基保護，當反應結束后，再將Ac、Bz和dmf基團切除。在這里，將Oligo從CPG上剪切下來和脫除保護基的反應稱為氨解反應。氨解反應的主要包括：（1）將Oligo從固相載體上切割下來；（2）將Oligo的3’-OH暴露；（3）將A、C、G堿基上的保護基Ac、Bz、dmf切除；（4）將磷酸上的氰乙基切除。

氨解反應最初采用氨水進行，其問題主要包括反應時間長，55℃反應需要16小時，65℃反應需要8小時；在反應過程中需要將合成柱浸泡在氨水中，容易造成交叉污染；由于氨水可以溶解Oligo，后處理步驟繁瑣；氨水中的雜質會積累，造成Oligo污染。后來研發的甲胺:氨水=1:1（AMA）的氨解反應體系大大降低了反應時間（M.P. Reddy, N.B. Hanna,and F. Farooqui, Nucleos. Nucleot., 1997, 16, 1589-1598.），但是仍然存在交叉污染和后處理步驟繁瑣等問題。氣相氨解采用氨氣為活性介質，以耐高壓的氨解鍋為反應容器，在高溫高壓的反應條件下進行氨解反應。氣相氨解的優勢在于反應快速高效、操作簡單，但是存在對設備要求高、需要使用有毒氣體、存在安全隱患、污染環境、對引物的結構破壞性較大的缺點。微波氨解是近年來廣泛應用的工藝，主要以微波作為加熱手段，但是在實際操作過程中，微波加熱很容易造成受熱不均勻，持續加熱會引起液體爆沸，造成損失和引起交叉污染。

CN109956987A公開了一種用于在DNA固相合成后進行氨解的方法，包括以下步驟：1)向包括用于合成DNA片段的固相載體的合成柱內加入氨解組合物；2)將所述合成柱置于裝有氨解緩沖液的可密封容器內，并保持所述合成柱位于所述氨解緩沖液的液面上方；以及3)以微波處理所述可密封容器，使得所述固相載體處于所述氨解緩沖液的蒸汽氣氛中；4)取出所述合成柱，以洗脫液處理所述固相載體并收集流出液。但是該方法仍然存在微波加熱受熱不均勻、容易造成損傷或引起交叉污染的問題。

因此，需要研發一種新的氨解方法，反應條件溫和，不會破壞引物結構，解決現有技術存在的問題。

發明內容