[發(fā)明專利]一種利用牡蠣富集分離弧菌噬菌體的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010826401.8 | 申請日： | 2020-08-17 |
| 公開（公告）號： | CN112080476B | 公開（公告）日： | 2022-08-19 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 羅鵬;李卓波;高永利;江曉;胡超群 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國科學(xué)院南海海洋研究所 |
| 主分類號： | C12N7/00 | 分類號： | C12N7/00 |
| 代理公司： | 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001 | 代理人： | 陳潔娣;劉明星 |
| 地址： | 511458 廣東*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 利用 牡蠣 富集 分離 弧菌 噬菌體 方法 | ||
本發(fā)明公開了一種利用牡蠣富集分離弧菌噬菌體的方法。該方法包括牡蠣組織勻漿、牡蠣組織樣品中弧菌裂解、噬菌體粒子釋放、離心獲得包含噬菌體粒子的上清液、噬菌體富集擴(kuò)大培養(yǎng)、雙層平板分離、雙層平板純化、純化噬菌體增殖等關(guān)鍵步驟。本發(fā)明提供的利用牡蠣富集分離弧菌噬菌體的方法具有高效、簡單、快速、成功率高等優(yōu)點(diǎn)。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用牡蠣富集分離弧菌噬菌體的方法。
背景技術(shù)
隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量也不斷提高，高密度養(yǎng)殖成為水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要方式。在高密度養(yǎng)殖模式下極易爆發(fā)病害，其中弧菌病是海水養(yǎng)殖中最為常見的細(xì)菌性病害，弧菌種類眾多，弧菌病爆發(fā)對我國以及世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)均造成了巨大的損失。
當(dāng)前弧菌病防治主要采用化學(xué)和生物方法。化學(xué)方法主要是采用消毒劑和抗生素藥物，抗生素藥物在水生環(huán)境的應(yīng)用造成了種種問題，包括水產(chǎn)品安全、細(xì)菌耐藥和耐藥基因的快速傳播等。以前的許多研究表明，環(huán)境分離的弧菌株已經(jīng)呈現(xiàn)廣泛的耐藥性。因此，在社會日益注重環(huán)境保護(hù)和食品安全的背景下，抗生素藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用日益受到嚴(yán)格限制。發(fā)展替代抗生素的生物防治技術(shù)逐漸成為研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)。其中，應(yīng)用噬菌體生物防治弧菌被認(rèn)為是一種環(huán)保、高效和特異的方式。
噬菌體制劑開發(fā)的核心是獲得用于高效裂解致病菌的噬菌體，然而由于弧菌噬菌體在天然水體中的豐度較低，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，很難通過海水富集的方法得到弧菌噬菌體。專利（CN102524131B)公開了一種利用海水富集弧菌噬菌體與生物防制宿主菌的方法，該方法是在海區(qū)或者養(yǎng)殖池進(jìn)行，占地面積大，通過復(fù)雜的程序和長期累積富集分離弧菌噬菌體，其操作難度大、過程繁瑣、耗時非常長（長達(dá)數(shù)月）、效率低，因此并不適合作為一種常規(guī)和頻繁使用的方法進(jìn)行操作。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用牡蠣富集分離弧菌噬菌體的方法。該方法包括牡蠣組織勻漿、牡蠣組織樣品中弧菌裂解、噬菌體粒子釋放、離心獲得包含噬菌體粒子的上清液、噬菌體富集擴(kuò)大培養(yǎng)、雙層平板分離、雙層平板純化、純化噬菌體增殖等關(guān)鍵步驟。使用該方法可以大幅提高分離獲得弧菌噬菌體的成功率。
具體的，所述的一種利用牡蠣富集分離弧菌噬菌體的方法，包括以下步驟：
（1）將牡蠣組織勻漿，往牡蠣勻漿糊狀物中加入滅菌海水，震蕩混勻，離心，取上清液，將上清液過濾，收集噬菌體初級濾液；
（2）使用LB或2216E培養(yǎng)基培養(yǎng)弧菌，將弧菌菌液加至步驟（1）的噬菌體初級濾液，得到混合液，然后加入高倍數(shù)濃縮的LB或2216E培養(yǎng)基，培養(yǎng)3~48 h，離心，取上清液，將上清液過濾，取濾液，然后進(jìn)行梯度稀釋，得到各級稀釋濾液；
（3）使用LB或2216E培養(yǎng)基培養(yǎng)弧菌，培養(yǎng)至OD600nm為0.6~1.0，得到宿主菌；分別將步驟（2）的各級稀釋濾液與宿主菌混合，得到混合液；將混合液加至一定溫度的含瓊脂的LB或2216E培養(yǎng)基中，迅速混勻，立即傾倒在LB或2216E固體培養(yǎng)基上，待冷卻凝固后，倒置培養(yǎng)過夜，得到雙層平板；
（4）取噬菌斑數(shù)量為50~500PFU的雙層平板，根據(jù)噬菌斑的大小，挑取數(shù)個不同形態(tài)的噬菌斑進(jìn)行純化；
（5）取純化后的噬菌斑，經(jīng)磨碎后，加入LB或2216E培養(yǎng)基和弧菌菌液培養(yǎng)至透明裂解，離心，取上清液，將上清液過濾，收集過濾液，即得到弧菌噬菌體。
優(yōu)選，步驟（1）中，將牡蠣組織勻漿具體為：取鮮活牡蠣，撬開牡蠣，用滅菌的解剖刀切除外套膜、腮、消化腺及腸道，取牡蠣組織按100 g/1.5 mL的比例加入氯仿，研磨勻漿至糊狀，得到牡蠣勻漿糊狀物。
優(yōu)選，步驟（1）中，牡蠣勻漿糊狀物與滅菌海水是按1g:2~4 mL比例混合；所述的離心是在10000 g，離心5~15 min。
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