[發明專利]腎活檢免疫熒光冰凍剩余組織重制石蠟切片的方法

在審

• 申請號: 202010813652.2
• 申請日: 2020-08-13
• 公開（公告）號: CN111879590A
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 周雅麗;邢國蘭
• 申請（專利權）人: 鄭州大學第一附屬醫院
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/30;G01N1/36
• 代理公司: 鄭州三陽專利代理事務所(普通合伙) 41175
• 代理人: 范向南

1.一種腎活檢免疫熒光冰凍剩余組織重制石蠟切片的方法，其特征在于：包括以下步驟：

第一步、腎活檢免疫熒光冰凍剩余組織儲存

腎穿刺取出的一部分腎組織，經OCT膠包埋后，及時迅速利用冰凍切片機對冰凍腎組織進行切片供免疫熒光標記染色，剩余未切片的冰凍腎組織，快速用OCT膠再次封閉包埋放入凍存管中-80℃超低溫冰箱儲存；

第二步、制作石蠟切片

（1）解凍冰凍腎組織并溶解OCT膠

將第一步儲存在-80℃超低溫冰箱內的冰凍腎組織取出，室溫條件下，迅速放入PBS緩沖溶液中，使冰凍腎組織解凍并快速充分溶解OCT膠；

（2）固定

將腎組織從PBS緩沖溶液中取出，迅速放入10%中性緩沖甲醛固定液中固定，固定2~4小時；

（3）脫水

將固定后的腎組織放入梯度酒精內進行脫水處理；

（4）透明

利用二甲苯對脫水后的腎組織進行透明處理；

（5）浸蠟

將透明處理后的腎組織放入熔化的石蠟液中浸漬2小時；

（6）包埋

將腎組織從熔化的石蠟液中取出，并將其迅速貼附于包埋盒內，石蠟液包埋后置于速凍臺上，使石蠟凝固；

（7）石蠟切片

采用石蠟切片機將石蠟包埋的腎組織切片，切片厚度2μm，將石蠟切片放入恒溫水浴鍋內展片，恒溫水浴鍋溫度控制在45~48℃，之后將石蠟切片從水浴鍋內撈出，放入干燥箱內烤片，干燥箱設定烤片溫度70-80℃，烤片時間為30~40分鐘；

（8）染色

對步驟（7）中烤片后的石蠟切片進行特殊染色處理；

（9）脫水

先將步驟（8）中染色后的石蠟切片放入無水乙醇中浸泡，對石蠟切片進行脫水處理；

（10）透明與封片

將脫水后的石蠟切片放入二甲苯中浸泡，之后，采用全自動封片機將石蠟切片直接封片；至此完成石蠟切片的制作。

2.根據權利要求1所述的腎活檢免疫熒光冰凍剩余組織重制石蠟切片的方法，其特征在于：第二步、制作石蠟切片的步驟（1）中，所述的PBS緩沖液pH值為7.2-7.6。

3.根據權利要求1所述的腎活檢免疫熒光冰凍剩余組織重制石蠟切片的方法，其特征在于：第二步、制作石蠟切片的步驟（1）中，準備三個裝有PBS緩沖液的容器，將冰凍腎組織依次浸沒在三個容器內的PBS緩沖液中，每個容器浸泡一分鐘。

4.根據權利要求1所述的腎活檢免疫熒光冰凍剩余組織重制石蠟切片的方法，其特征在于：第二步、制作石蠟切片的步驟（2）中，所述的10%中性緩沖甲醛包括磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甲醛溶液及蒸餾水，配置時，先將0.4g磷酸二氫鈉與0.65g磷酸氫二鈉充分溶解于100ml蒸餾水中制成混合溶液，然后將10ml甲醛溶液加入到混合溶液中并混合均勻。

5.根據權利要求1所述的腎活檢免疫熒光冰凍剩余組織重制石蠟切片的方法，其特征在于： 第二步、制作石蠟切片的步驟（3）中，準備裝有70%酒精的容器A，準備裝有80%酒精的容器B，準備裝有90%酒精的容器C，準備裝有95%酒精的容器D，準備裝有95%酒精的容器E，準備裝有無水乙醇的容器F，準備裝有無水乙醇的容器G，將固定后的腎組織依次浸泡在容器A、容器B、容器C、容器D、容器E、容器F、容器G中，每個容器浸泡30分鐘。

6.根據權利要求1所述的腎活檢免疫熒光冰凍剩余組織重制石蠟切片的方法，其特征在于： 第二步、制作石蠟切片的步驟（4）中，準備兩個裝有二甲苯的容器，將脫水后的腎組織依次浸泡在兩個容器中的二甲苯內，每個容器浸泡10分鐘。

7.根據權利要求1所述的腎活檢免疫熒光冰凍剩余組織重制石蠟切片的方法，其特征在于： 第二步、制作石蠟切片的步驟（5）中，準備三個裝有石蠟液的容器，將脫水后的腎組織依次浸泡在三個容器內的石蠟液中，每個容器浸泡40分鐘。