[發(fā)明專利]銅綠假單胞菌胞外酶U的核酸適配體ExoU01及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010808843.X
• 申請(qǐng)日: 2020-08-12
• 公開（公告）號(hào): CN111793631A
• 公開（公告）日: 2020-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳冬;王開宇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福州市長(zhǎng)樂區(qū)寶愛冬醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/115
• 分類號(hào): C12N15/115;G01N33/569;G01N33/573;A61K31/7088;A61P31/04
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本發(fā)明涉及一種銅綠假單胞菌胞外酶U的核酸適配體ExoU01及其應(yīng)用，該核酸適配體ExoU01的序列包括：5'?TCACTCTTCGTAGCCGGTATTCAATCTTCCCGTGAACT?3'。本發(fā)明的核酸適配體ExoU01能高親和力、高特異性地與銅綠假單胞菌胞外酶U結(jié)合，以核酸適配體ExoU01作為銅綠假單胞菌胞外酶U的識(shí)別元件，建立銅綠假單胞菌胞外酶U的檢測(cè)方法、制備檢測(cè)試劑、研制胞外酶U拮抗藥物，可用于銅綠假單胞菌感染的診斷、治療以及銅綠假單胞菌胞外酶U生物學(xué)功能研究等應(yīng)用領(lǐng)域，具有方法簡(jiǎn)便、快速、特性好等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種銅綠假單胞菌胞外酶U的核酸適配體ExoU01及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種常見的革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，在各種環(huán)境條件下具有最佳適應(yīng)性。銅綠假單胞菌雖為專性需氧菌，也可以通過硝酸鹽或其他電子受體進(jìn)行厭氧呼吸。因此，銅綠假單胞菌在土壤、水或污水以及人類、動(dòng)物或植物宿主中廣泛存在，并在全世界廣泛傳播。健康人被銅綠假單胞菌感染是非常罕見的，但作為一種機(jī)會(huì)致病菌，它經(jīng)常在免疫功能低下的囊性纖維化、燒傷或艾滋病患者中寄生。感染范圍從內(nèi)膜炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎和敗血癥到慢性肺部感染。由于銅綠假單胞菌天然對(duì)不同抗生素或化療藥物耐藥，其根除困難且死亡率高。

胞外酶是銅綠假單胞菌重要的毒力因子。胞外酶U（ExoU）的長(zhǎng)度為126個(gè)氨基酸，分子量為12596Da。胞外酶U具有磷脂酶A的活性，可導(dǎo)致宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成障礙，可以導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞膜的損傷以及快速的細(xì)胞壞死，胞外酶U在急性肺炎的小鼠模型中是主要的毒素，細(xì)胞的壞死可以引發(fā)過度的炎性反應(yīng)，同時(shí)上皮細(xì)胞的破壞可以使大量的炎癥細(xì)胞因子進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，最終導(dǎo)致膿毒癥。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道（《中華兒科雜志》，2012，50：672-677），胞外酶U的檢出率為34.21%。由于銅綠假單胞菌表達(dá)多種毒力因子，毒力因子在致病力和致病機(jī)制方面存在差異，且不同銅綠假單胞菌的毒力因子表達(dá)譜存在差異，因此，銅綠假單胞菌感染者的毒力因子表達(dá)情況，對(duì)于銅綠假單胞菌感染的病原學(xué)診斷、病情發(fā)展預(yù)測(cè)、治療方案制定均有重要作用。

目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)銅綠假單胞菌胞外酶U的檢測(cè)研究大多數(shù)采用的是分子生物學(xué)技術(shù)，其中以PCR、熒光實(shí)時(shí)定量PCR等的運(yùn)用較多。雖然直接檢測(cè)銅綠假單胞菌胞外酶U更加方便、快捷，但由于抗體昂貴，免疫學(xué)技術(shù)在臨床銅綠假單胞菌檢測(cè)中應(yīng)用較少。

核酸適配體（Aptamer）是一段寡核苷酸序列（DNA或RNA）。 通常是利用體外篩選技術(shù)——指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands byexponential enrichment，SELEX），從核酸分子隨機(jī)文庫(kù)中篩選得到的寡核苷酸片段。核酸適配體與靶標(biāo)的結(jié)合具有高親和力、高特異性等特點(diǎn)。作為核酸類分子，核酸適配體可直接合成并進(jìn)行各種化學(xué)修飾，具有成本低、制備快等優(yōu)點(diǎn)。將核酸適配體作為靶標(biāo)的識(shí)別元件，已應(yīng)用于各種靶標(biāo)的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。已有研究將核酸適配體作為銅綠假單胞菌的識(shí)別元件，建立了可檢測(cè)銅綠假單胞菌菌體的傳感器、熒光雜交等新方法（Mikrochim Acta。2018，185：377）。如能利用核酸適配體的優(yōu)勢(shì)，建立快速、準(zhǔn)確的銅綠假單胞菌胞外酶U的檢測(cè)方法，將具有廣闊的臨床和基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值。

本發(fā)明提出一種特異識(shí)別銅綠假單胞菌胞外酶U的核酸適配體ExoU01。ExoU01是以大腸桿菌表達(dá)的銅綠假單胞菌胞外酶U為靶標(biāo)，通過SELEX技術(shù)從核酸分子隨機(jī)文庫(kù)中體外人工篩選并經(jīng)序列優(yōu)化后獲得。核酸適配體ExoU01能夠特異識(shí)別銅綠假單胞菌胞外酶U，而不結(jié)合其他銅綠假單胞菌毒素。目前尚未見以銅綠假單胞菌胞外酶U為靶標(biāo)篩選核酸適配體并應(yīng)用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，本發(fā)明的目的是提供一種核酸適配體ExoU01，其能夠特異性識(shí)別銅綠假單胞菌的胞外酶U。

具體技術(shù)方案如下：