[發明專利]基于鯊魚抗體可變區V-NAR的噬菌體文庫及其構建方法

有效

• 申請號: 202010808119.7
• 申請日: 2020-08-12
• 公開（公告）號: CN112301431B
• 公開（公告）日: 2023-01-31
• 發明（設計）人: 鄭文云;劉秋麗;馬興元
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/02;C12N15/70;C12N1/21;C07K16/28;C12R1/19
• 代理公司: 上海三和萬國知識產權代理事務所(普通合伙) 31230
• 代理人: 張民華

本發明提供基于鯊魚抗體可變區V?NAR噬菌體的合成肽庫及其構建方法，設計V?NAR框架序列，包括FR區、CDR1區、HV2區以及HV4區和隨機化的CDR3區氨基酸序列，利用重疊延伸PCR獲得上述完整的V?NAR基因片段，并將其克隆至噬菌粒載體，轉化至大腸桿菌，構建合成噬菌體文庫。本發明提供一種新型V?NAR框架序列，可作為鯊魚V?NAR抗體庫的通用骨架，為抗體庫的構建提供新的理論基礎；利用構建的噬菌體庫所篩選的Anti?PD?L1納米抗體，具有潛在應用價值，可為新型抗腫瘤藥物研發與獲得提供新品種；所構建的基于鯊魚抗體IgNAR的V?NAR噬菌體庫，可作為不同抗原的篩選平臺，具有極高的生物醫學應用價值。

技術領域

本發明涉及生物醫學與分子生物學領域，尤其涉及基于鯊魚抗體可變區V-NAR的噬菌體文庫及其構建方法。

背景技術

鯊魚體內存在一類只含重鏈的抗體IgNAR，其可變區V-NAR是目前已知分子量最小的抗體片段，被稱為納米抗體。V-NAR具有親和力高、穩定性強、可溶性好、易偶聯改造和良好的組織滲透能力等優勢，因而在生物醫藥行業具有廣闊的應用前景。

噬菌體展示庫是目前構建文庫廣泛應用的方法。雖然免疫文庫的抗體靶特異性較高，但是其存在局限性。例如，不僅免疫時間過長，只針對單一的免疫抗原，而且對抗原的要求也苛刻。天然文庫的多樣性較為豐富，但其文庫的抗體結合力較弱。然而，合成抗體庫具有庫容大、多樣性豐富、可用于篩選多種抗原以及生產成本低等優勢，是目前高親和力抗體獲得的主要來源，對于V-NAR類藥物的研發有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種基于鯊魚抗體可變區V-NAR的噬菌體文庫的構建方法，可作為鯊魚V-NAR抗體庫的通用骨架，為抗體庫的構建提供新的理論基礎。

本發明的第二個目的在于，提供一種利用本發明構建方法構建獲得的基于鯊魚抗體可變區V-NAR的噬菌體文庫。

為了實現上述目的，本發明提供了基于鯊魚抗體可變區V-NAR的噬菌體文庫的構建方法，設計V-NAR框架序列，包括FR區、CDR1區、HV2區以及HV4區和隨機化的CDR3區氨基酸序列，利用重疊延伸PCR獲得完整的V-NAR基因片段，并將其克隆至噬菌粒載體，轉化至大腸桿菌，構建合成噬菌體文庫；

所述FR區包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1區、SEQ ID NO.2所示的FR2區、SEQ ID NO.3所示的FR3區和SEQ ID NO.4所示的FR4區，所述CDR1區的氨基酸序列如SEQID NO.5所示，所述HV2區的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述HV4區的氨基酸序列如SEQID NO.7所示。

作為一個優選方案，利用NNK突變的方法設計不同長度的CDR3，從而使CDR3區序列多樣化。比如設計3種不同長度的CDR3序列,分別為13、18和22個氨基酸；同時利用NNK隨機突變的方法，(N代表4種堿基，A、T、C和G，K代表2種堿基，T和G)對序列隨機化，減少終止子產生，增加文庫序列的多樣性和有效性。

為實現上述的第二個目的，本發明提供了利用上述構建方法構建獲得的基于鯊魚抗體可變區V-NAR的噬菌體文庫，保藏編號為：CCTCC NO:M 2020350。

在本發明的優選實施例中，利用固相篩選法從合成的噬菌體庫中獲得PD-L1特異性納米抗體，篩選獲得5株抗PD-L1納米抗體，其均與PD-L1特異性結合，可阻斷PD-1與PD-L1的結合，并具有優良的穩定性，所述抗體的序列包括FR區、CDR區以及HV區；

所述FR區包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1區、SEQ ID NO.2所示的FR2區、SEQ ID NO.3所示的FR3區和SEQ ID NO.4所示的FR4區；

所述CDR區包括氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的CDR1區和SEQ ID NO.8——SEQID NO.12任一所示的CDR3區；