[發(fā)明專利]中樞神經(jīng)系統(tǒng)中毒的體外模型及評價(jià)重活化劑療效的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010800982.8
• 申請日: 2020-08-11
• 公開（公告）號: CN111893045B
• 公開（公告）日: 2022-11-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王永安;楊軍;李堯;黃靜宜;隋昕;孟凡榮
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 中國貿(mào)促會(huì)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 11038
• 代理人: 崔婧;劉海羅

1.一種建立中樞神經(jīng)系統(tǒng)有機(jī)磷化合物中毒的體外模型的方法，包括如下步驟：

(1)獲得transwell體外血腦屏障模型；

(2)將濃度0.065～0.20mg/ml的乙酰膽堿酯酶溶液和體積百分比濃度為0.5×10^-8～10^-5的有機(jī)磷化合物溶液以(1～10):1體積比依次加入至所述transwell體外血腦屏障模型的下池中，靜置1至10分鐘，得到中樞神經(jīng)系統(tǒng)有機(jī)磷化合物中毒的體外模型。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(2)中，有機(jī)磷化合物選自含碳-磷單鍵的有機(jī)磷化合物和含有機(jī)官能團(tuán)的磷酸衍生物。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(2)中，有機(jī)磷化合物選自沙林和諾維喬克。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，步驟(2)中，有機(jī)磷化合物為沙林，有機(jī)磷化合物溶液的體積百分比濃度為10^-7～10^-5。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，步驟(2)中，有機(jī)磷化合物溶液的體積百分比濃度為10^-6。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，步驟(2)中，有機(jī)磷化合物為諾維喬克，有機(jī)磷化合物溶液的體積百分比濃度為0.1×10^-8～10^-5。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，步驟(2)中，有機(jī)磷化合物溶液的體積百分比濃度為0.5×10^-8。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(2)中，乙酰膽堿酯酶溶液為1～2ml，有機(jī)磷化合物溶液為0.2～1ml。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(2)中，乙酰膽堿酯酶溶液和/或有機(jī)磷化合物溶液采用的溶劑為ECM-PRF基礎(chǔ)液。

10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(1)中，通過如下的步驟獲得transwell體外血腦屏障模型：

在位于培養(yǎng)板的板孔內(nèi)的transwell小室的膜上接種內(nèi)皮細(xì)胞，向上池和下池加入培養(yǎng)基，待培養(yǎng)至細(xì)胞長滿膜表面，即得到所述transwell體外血腦屏障模型。

11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于如下a至g中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：

a.所述內(nèi)皮細(xì)胞為腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞；

b.transwell小室中膜的材料為聚乙烯膜和/或聚碳酯膜；

c.在接種前，將纖維粘連蛋白負(fù)載在transwell小室的膜表面；

d.細(xì)胞接種的密度為每個(gè)板孔1×10⁵～5×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml；

e.培養(yǎng)過程中多次更換培養(yǎng)基；

f.培養(yǎng)時(shí)間為8～16天；

g.待培養(yǎng)至細(xì)胞長滿膜表面且細(xì)胞融合，即得到所述transwell體外血腦屏障模型。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，第a項(xiàng)中，所述內(nèi)皮細(xì)胞選自鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、豬腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、牛腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和bEnd.3細(xì)胞。

13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，第a項(xiàng)中，所述內(nèi)皮細(xì)胞為鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，第a項(xiàng)中，所述腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞為原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，第a項(xiàng)中，通過兩次酶消化法提取得到腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。