[發(fā)明專利]一種腫瘤特異性T細(xì)胞的培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010800226.5
• 申請(qǐng)日: 2020-08-11
• 公開（公告）號(hào): CN113293130B
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高全立;李鐵鵬;王瑤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南省腫瘤醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/0783
• 分類號(hào): C12N5/0783
• 代理公司: 北京精金石知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11470
• 代理人: 尉月麗

本發(fā)明提供了一種用于培養(yǎng)腫瘤特異性T細(xì)胞的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中包括濃度1g/L并≦4g/L的氯化鉀，優(yōu)選為含3g/L氯化鉀的X?VIVO培養(yǎng)基、GT?T551培養(yǎng)基、ALYS505N?0培養(yǎng)基。基于前述培養(yǎng)基，本發(fā)明還提供了一種腫瘤特異性T細(xì)胞的培養(yǎng)方法，在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中添加有濃度1g/L并≦4g/L的氯化鉀。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法培養(yǎng)出的細(xì)胞產(chǎn)品中腫瘤特異性細(xì)胞比例更高，且記憶性T細(xì)胞的比例也得到提高，適于應(yīng)用于臨床提高過繼免疫治療效果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤特異性T細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

惡性腫瘤是一類嚴(yán)重危害人類生命健康的常見病，惡性腫瘤的治療方法主要包括手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療等。但上述幾種治療方法帶來的治療效果十分有限，目前以免疫學(xué)為主要方向的生物治療方法越來越表現(xiàn)出了優(yōu)勢(shì)，其中腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞(CTL)在抗腫瘤免疫過程中起著重要的作用。

腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞是T細(xì)胞的一個(gè)亞群，CTL前提經(jīng)抗原刺激和細(xì)胞因子的輔助下增殖分化，活化成為具有特異殺傷活性的T細(xì)胞。CTL是腫瘤過繼免疫療法的主要媒介，過繼免疫療法是指向腫瘤患者轉(zhuǎn)輸具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞，直接殺傷腫瘤或激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)來殺傷腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療腫瘤的目的。

使用CTL進(jìn)行過繼免疫療法的關(guān)鍵之一是設(shè)法在體外獲得大量的CTL，即篩選具有腫瘤特異性殺傷作用的效應(yīng)細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)過繼免疫治療高效低毒的特點(diǎn)。具有腫瘤抗原特異性的T細(xì)胞具有殺瘤譜廣、殺瘤活性高、增殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)。如何提高體外培養(yǎng)產(chǎn)物中CTL細(xì)胞數(shù)量及活性、增強(qiáng)其抗腫瘤特異性是提高過繼免疫治療效果的關(guān)鍵。

目前對(duì)特異性T細(xì)胞的培養(yǎng)方法的研究主要集中在誘導(dǎo)方式上。

中國(guó)專利201910420697.0中公開了一種腫瘤特異性T細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，該方法以腫瘤患者的外周血為材料，在外周血中加入PD-1抗體，然后進(jìn)行孵育，分離單個(gè)核細(xì)胞后種入由重組人纖連蛋白片段和抗人CD3活化抗體進(jìn)行包被的培養(yǎng)瓶。該方法取材更便捷，最終獲得的T細(xì)胞腫瘤特異性高，且同時(shí)包含有CD4陽性和CD8陽性的T細(xì)胞。但該方法獲得的終產(chǎn)品中CD4陽性細(xì)胞和CD8陽性細(xì)胞所包含的效應(yīng)記憶性T細(xì)胞比例較低，有進(jìn)一步優(yōu)化的空間。

中國(guó)專利200510038728.4中公開了一種腫瘤抗原特異性T淋巴細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法，涉及聯(lián)合使用白介素2、白介素15和激發(fā)性抗CD28單克隆抗體以及腫瘤抗原負(fù)載的抗原遞呈細(xì)胞，誘導(dǎo)T細(xì)胞變成細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。

特異性T細(xì)胞的培養(yǎng)基成分對(duì)培養(yǎng)效果的影響目前還有待深入研究。

中國(guó)專利201810955224.6中公開了一種免疫細(xì)胞培養(yǎng)基及其應(yīng)用，對(duì)無水氯化鈣等多種無機(jī)鹽、L-亮氨酸等多種氨基酸、白介素2、白介素4等組分對(duì)免疫細(xì)胞培養(yǎng)的影響進(jìn)行了探索。但該發(fā)明提供的培養(yǎng)基成分種類復(fù)雜多變，成分濃度范圍較大，無法確定最佳培養(yǎng)效果的培養(yǎng)基的具體成分濃度，在培養(yǎng)的選擇中帶來了較大難度。

一般特異性T細(xì)胞或免疫細(xì)胞培養(yǎng)基中的氯化鉀常規(guī)濃度較低(中國(guó)專利201810955224.6：310.5mg/L～311.3mg/L；中國(guó)專利201711319524.7：10-1000mg/L；中國(guó)專利201711321217.2：10-1000mg/L；中國(guó)專利201710797665.3：250-500mg/L)，本領(lǐng)域常規(guī)使用的最高氯化鉀濃度為1g/L，本發(fā)明通過優(yōu)化培養(yǎng)基中氯化鉀的濃度提高了細(xì)胞培養(yǎng)終產(chǎn)物總特異性T細(xì)胞和記憶性T細(xì)胞的比例。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種用于培養(yǎng)腫瘤特異性T細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。常規(guī)腫瘤特異性T細(xì)胞中氯化鉀含量最高為1g/L，本發(fā)明意外發(fā)現(xiàn)了含高濃度氯化鉀的培養(yǎng)基所培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)物中，腫瘤特異性細(xì)胞比例更高，且記憶性T細(xì)胞的比例也得到提高。

一方面，本發(fā)明提供了一種用于腫瘤特異性T細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。