[發明專利]一種提高蛋白表達效率的方法

在審

• 申請號: 202010796829.2
• 申請日: 2020-08-10
• 公開（公告）號: CN111850028A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 夏澤旭
• 申請（專利權）人: 武漢恒意賽生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/67
• 代理公司: 鄭州歐凱專利代理事務所(普通合伙) 41166
• 代理人: 李英

本發明公開了一種提高蛋白表達效率的方法，包括如下步驟：S1將含蛋白基因的重組載體轉化畢赤酵母，所述重組載體為重組表達載體；S2通過在目的基因的起始密碼子ATG后插入一段編碼特定氨基酸片段的核苷酸來提高表達效率；S3在起始密碼子ATG后4?21位核苷酸序列以腺嘌呤和胸腺嘧啶的密碼子取代部分胞嘧啶和鳥嘌呤的密碼子，移除起始密碼子ATG后4?21位核苷酸組成的莖環發夾結構；S4以載體的快速定點誘變試劑盒Stratagene QuikChange Site?directed Mutagenesis Kit構建多個突變菌株。本發明具有較高的通用性和可行性，不僅可以用于改造任意目的基因以提高其表達效率，還可以用于構建具有高表達效率特征的表達載體，使目的基因的蛋白表達效率顯著提高。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種提高蛋白表達效率的方法。

背景技術

巴斯德畢赤酵母表達系統是目前最優秀、應用最廣泛的外源基因表達系統之一。巴斯德畢赤酵母表達系統作為真核表達系統，有許多其它蛋白表達系統所不具備的優點。可對表達的蛋白進行加工折疊和翻譯后修飾，從而使表達出的蛋白具有生物活性，具有強有力的乙醇氧化酶(AOX1)基因啟動子，可嚴格調控外源蛋白的表達，營養要求低，培養基廉價，生長快，與昆蟲、哺乳動物等高等真核細胞相比，易于進行操作和培養。巴斯德畢赤酵母對需氧生長有強的偏好，這一生理學特性使它能高密度發酵生長，表達量高，有利于工業放大生產。巴斯德畢赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，有利于外源蛋白的分離和純化。表達的外源蛋白可分泌到胞外，分泌的內源蛋白少，外源蛋白分離純化簡便；外源基因通過質粒整合到基因組上，基因工程菌株遺傳穩定性好；胞內表達蛋白的分選和區域化，增加了表達蛋白的穩定性，減少表達產物對宿主菌的毒害作用；糖基化程度低，與釀酒酵母相比，巴斯德畢赤酵母不產生過度的糖基化；所分泌的糖蛋白的免疫原性較低，更利于臨床應用。

高密度發酵是畢赤酵母提高蛋白表達量的一種重要策略，發酵工藝是高密度發酵的一個重要因素。但是高密度發酵過程中，各種條件難以控制，酵母細胞內部自由基積累嚴重，容易導致酵母死亡，進而影響了外源蛋白表達。

發明內容

基于背景技術存在的技術問題，本發明提出了一種提高蛋白表達效率的方法。

本發明提出的一種提高蛋白表達效率的方法，包括如下步驟：

S1將含蛋白基因的重組載體轉化畢赤酵母，所述重組載體為重組表達載體；

S2通過在目的基因的起始密碼子ATG后插入一段編碼特定氨基酸片段的核苷酸來提高表達效率；

S3在起始密碼子ATG后4-21位核苷酸序列以腺嘌呤和胸腺嘧啶的密碼子取代部分胞嘧啶和鳥嘌呤的密碼子，移除起始密碼子ATG后4-21位核苷酸組成的莖環發夾結構；

S4以載體的快速定點誘變試劑盒Stratagene QuikChange Site-directedMutagenesis Kit構建多個突變菌株；

S41控制重組畢赤酵母生長階段的溫度為30℃，使用25％氨水和30％磷酸調節pH，使體系的pH控制在5.5，并按預設時間加入10ng/ml-1μg/ml的褪黑激素；

S5在高效表達階段，當補料生長階段結束后，將發酵溫度降至22℃，同時流加含12mL/LPTM1的100％的甲醇；

S6控制發酵液中甲醇濃度達到20g/L，誘導90h后結束發酵；

S7用XL1-Blue超級感受態菌株大量復制、突變和保存重組蛋白的質粒；通過 PCR擴增和測序實驗多種基因改造的突變；

S8將重組蛋白的質粒轉化進 BL21(DE3)pLysS超級感受態菌株菌株，在LB培養基中培養并定時檢測吸光度， 并加入誘導劑誘導重組蛋白過量表達；經過SDS-PAGE分離的蛋白質條帶的分析測定，篩選出能提供最高產量的重組蛋白的突變體菌株。