[發(fā)明專利]一種利用轉(zhuǎn)分化技術(shù)誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程至神經(jīng)細(xì)胞模型的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010795950.3
• 申請日: 2020-08-10
• 公開（公告）號: CN111876443A
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 樊晉宇;池金鵬;趙亞琪;程雪;張?jiān)娹?/a>
• 申請（專利權(quán)）人: 山東天川精準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;C12N5/10
• 代理公司: 北京中和立達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11756
• 代理人: 祝妍

1.一種誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程至神經(jīng)細(xì)胞模型的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

步驟1.以健康人類全血mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴(kuò)增ASCL1和MYT1 L全長基因，將PCR產(chǎn)物用8％的瓊脂糖凝膠電泳，把大小合適的條帶切下來進(jìn)行膠回收，并把膠回收的目的條帶和載體質(zhì)粒pLVX進(jìn)行雙酶切后純化，按目的片段和載體片段3:1的濃度比進(jìn)行混合和連接反應(yīng)，將連接好的質(zhì)粒通過DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂于有氨芐抗性的LB固體平板，進(jìn)行篩選；

步驟2.包裝慢病毒：①轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞：取步驟1獲得的重組質(zhì)粒20μg，病毒包裝質(zhì)粒pMD2.G和pSPAX2分別10μg，加入超純水中，總體積為450μl，再加入50μl的2.5mol/L的CaCl₂混勻，然后將其與500μl的2X BES逐滴混合，室溫放置15-30min，均勻加入HEK293T細(xì)胞中，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8-16個(gè)小時(shí)后，用PBS洗滌兩次，換上新鮮培養(yǎng)液；②慢病毒收集：換液后48小時(shí)收集病毒，將含有慢病毒的培養(yǎng)液離心，去除細(xì)胞碎片，將上清離心，將病毒液濃縮為600μl；

步驟3.收集病毒前24小時(shí)，將精神分裂癥患者的皮膚成纖維細(xì)胞傳至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞匯合度為40％-70％時(shí)即可侵染，細(xì)胞侵染前換上新鮮培養(yǎng)液，各取600μl濃縮好的ASCL1、MYT1 L兩種慢病毒混合加入到待侵染的細(xì)胞中，30-36小時(shí)后，換上神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液，以后每2天換液，直至成纖維細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3所述的神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液配制方法如下：DMEM/F12培養(yǎng)基中加入1X的N2和B27，20ng/ml的βFGF，20ng/ml的EGF。

3.一種建立神經(jīng)細(xì)胞疾病模型的方法，其特征在于，所述神經(jīng)細(xì)胞由權(quán)利要求1所述的方法制備獲得。