[發(fā)明專利]一種糞便樣品總DNA提取方法

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• 申請日: 2020-08-07
• 公開（公告）號: CN111808846A
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發(fā)明（設計）人: 覃俊杰
• 申請（專利權）人: 深圳譜元科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 深圳市精英專利事務所 44242
• 代理人: 李瑩

本發(fā)明公開了一種糞便樣品總DNA提取方法，涉及DNA提取技術領域。該方法包括步驟：S1，對糞便樣品預處理，收集樣品中的菌體；S2，對菌體進行物理破碎；S3，將破碎后的樣品反復凍融2?5次之后，進行酶解處理；S4，將酶解后的樣品離心，取上清液，向其中加入0.6?1.5倍上清液體積的異丙醇進行沉淀處理；S5，將沉淀后的樣品離心，收集沉淀，對沉淀溶解之后進行DNA過柱純化，即得到糞便樣品總DNA。本發(fā)明提供的糞便樣品總DNA提取方法，有良好的通用性，可對不同類型的糞便樣品有效進行DNA提取，且可有效去除糞便中各種影響下游實驗的抑制因子，并能高效地回收糞便中的基因組DNA。

技術領域

本發(fā)明涉及DNA提取技術領域，尤其涉及一種糞便樣品總DNA提取方法。

背景技術

腸道是哺乳動物體內最大的消化器官，其中含有數(shù)量巨大的細菌菌群，形成了極其復雜的細菌微生態(tài)系統(tǒng)。腸道微生態(tài)系統(tǒng)包括多種多樣的細菌微生物，其中包含大量人體有益菌群，亦有對人體有害的菌。已有研究表明，動物腸道每天將產生2×10^11個脫落細胞，每克人的新鮮糞便中含有10^5個腸上皮細胞。對糞便中腸道微生物DNA、食品殘留樣品DNA，以及消化道腸道脫落細胞DNA的檢測可得到大量腸道微生物信息，間接地反映腸道微生物的變化情況。

糞便的成分復雜，其中含有的多聚糖、植物多糖、膽酸、膽鹽、膽色素、消化液、粘液等物質對Taq酶的活性有抑制作用，導致下游檢測失活；另外，含有的一些有機物如脂類、多酚等在DNA提取過程中很難去除，這些雜質不但易導致目標DNA的降解，還直接影響到后續(xù)研究的準確性。因此改進樣品保存方法及選擇合適的提取方法以得到優(yōu)質的DNA是糞便DNA成功進行下游檢測的關鍵。至今為止，國內外研究者發(fā)展了多種糞便DNA提取方法，如預處理-酚/氯仿抽提法、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)裂解法、異硫氰酸胍(GuSCN)裂解法等。

目前，實驗室使用的預處理-酚/氯仿抽提法、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)裂解法、異硫氰酸胍(GuSCN)裂解法等在不同物種的應用中缺乏通用性，提取技術繁瑣且耗時，提取的DNA用于PCR擴增的成功率也很低。而且核酸的回收率較低，損失量較大。

而專用的糞便DNA提取試劑盒有著較好的通用性，但昂貴的價格限制了該試劑盒的廣泛應用，因此構建一套效果好、通用性好、性價比高的糞便DNA提取方法，可以大大推進糞便DNA技術的推廣。

發(fā)明內容

本發(fā)明所要解決的技術問題是背景技術中提到的一些不足，提供一種效果好、成本低、穩(wěn)定性高、通用性好的糞便DNA提取方法。

需要說明的是，糞便DNA提取方法的實質是自糞便中提取排便者細胞中的DNA，所要解決的技術問題是使DNA自細胞中釋放出來，并在一系列的分離、沉淀和純化過程中不被破壞，從而得到濃度和純度較高的人的DNA樣本。

本發(fā)明提取核酸是通過化學裂解及物理破碎相結合的方法裂解細菌等微生物的細胞，從細胞中釋放出來的核酸分子經(jīng)過萃取離心，從而去除顆粒雜質及蛋白質等雜質，再經(jīng)過柱法純化DNA，最后得到高質量的符合實驗需求的純凈DNA。

為了解決上述問題，本發(fā)明提出以下技術方案：

一種糞便樣品總DNA提取方法，包括以下步驟：

S1，對糞便樣品預處理，收集樣品中的菌體；

S2，對菌體進行物理破碎；

S3，將破碎后的樣品反復凍融2-5次之后，進行酶解處理；

S4，將酶解后的樣品離心，取上清液，向其中加入0.6-1.5倍上清液體積的異丙醇進行沉淀處理；

S5，將沉淀后的樣品離心，收集沉淀，對沉淀溶解之后進行DNA過柱純化，即得到糞便樣品總DNA。

其進一步地技術方案為，所述的糞便樣品總DNA提取方法，步驟S1的具體操作為，