[發(fā)明專利]基于熒光素酶報(bào)告基因的生物活性檢測試劑

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010791653.1
• 申請(qǐng)日: 2020-08-07
• 公開（公告）號(hào): CN112195218A
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏繼波;肖會(huì)芝;錢近春
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州優(yōu)逸蘭迪生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/66
• 分類號(hào): C12Q1/66;C12Q1/6897
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 32103
• 代理人: 孫周強(qiáng)

本發(fā)明公開了基于熒光素酶報(bào)告基因的生物活性檢測試劑，包括底物緩沖液與螢火蟲熒光素酶底物；底物緩沖液包括兩性離子緩沖劑、鎂鹽、巰基還原劑、生物緩沖劑、高能化合物、輔酶、非離子型表面活性劑、溶劑。本發(fā)明開發(fā)的這款報(bào)告基因檢測試劑，同樣包括底物緩沖液及配套底物，在靈敏度（發(fā)光強(qiáng)度)和光穩(wěn)定性方面取得顯著的進(jìn)步，使其保持了相對(duì)的信號(hào)穩(wěn)定，同時(shí)發(fā)光強(qiáng)度獲得了較高的提升，使試劑的整體性能同時(shí)滿足科研的基因表達(dá)調(diào)控研究和企業(yè)的新藥開發(fā)，一方面可以應(yīng)用于科研領(lǐng)域如評(píng)估響應(yīng)元件如何控制基因表達(dá)等，另一方面可以應(yīng)用于新藥研發(fā)和生產(chǎn)中的藥物作用機(jī)制、生物活性、效力和穩(wěn)定性評(píng)估。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物試劑，具體涉及基于熒光素酶報(bào)告基因的生物活性檢測試劑。

背景技術(shù)

報(bào)告基因是一種易于測定的生物分析檢測方法，報(bào)告基因的種類多樣，如抗生素抗性蛋白、氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶（CAT）、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、螢火蟲熒光素酶等的編碼基因。其中，螢火蟲熒光素酶（Firefly Luciferase）由luc基因編碼，其蛋白分子量為61kDa，因螢火蟲熒光素酶在宿主細(xì)胞中無背景螢光，無需翻譯后修飾，酶測定的靈敏性和方便性以及蛋白質(zhì)合成與酶活性的緊密耦合等特性，使其成為報(bào)告基因的理想選擇。

螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因是以螢火蟲熒光素（luciferin）為底物來檢測螢火蟲熒光素酶活性的一種報(bào)告系統(tǒng)。螢火蟲熒光素在 ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，被螢火蟲熒光素酶催化進(jìn)行氧化脫羧反應(yīng)，產(chǎn)生激活態(tài)的氧化熒光（Oxyluciferin），并產(chǎn)生生物螢光（ Bioluminescence），通過熒光測定儀或多功能酶標(biāo)儀測定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光（圖1）。生物熒光與熒光素酶的啟動(dòng)子活性成比例，間接反映了細(xì)胞刺激物的生物學(xué)活性。

螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因檢測是基因表達(dá)調(diào)節(jié)研究的重要手段，目前已被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域。轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動(dòng)子中的特異序列結(jié)合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式作用元件實(shí)現(xiàn)共價(jià)結(jié)合，從而對(duì)基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用。螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因是檢測轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動(dòng)子中的特異順序結(jié)合及相互作用的重要手段。目前用于此類檢測的產(chǎn)品以閃光型底物為主，往往發(fā)光強(qiáng)度高，但光穩(wěn)定性差、淬滅率快，通常需要先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解處理，再通過相應(yīng)檢測試劑和底物進(jìn)行測試。

螢火蟲報(bào)告基因檢測也是一種將轉(zhuǎn)錄調(diào)控和報(bào)告基因偶聯(lián)表達(dá)，通過報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物活性判斷細(xì)胞刺激物（如小分子化合物、重組蛋白） 生物學(xué)活性的方法。效應(yīng)物激活其在細(xì)胞表面的結(jié)合位點(diǎn)后，通過報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物活性測定信號(hào)通路變化的活性，基于對(duì)信號(hào)通路了解的基礎(chǔ)上，將攜帶作用靶點(diǎn)反應(yīng)元件與報(bào)告基因的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，通過效應(yīng)物與相應(yīng)靶點(diǎn)的作用，啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)來檢測效應(yīng)物的生物學(xué)活性。例如抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）檢測，傳統(tǒng)ADCC檢測方法非常復(fù)雜，需要從外周血中分離單核細(xì)胞，并經(jīng)過多日培養(yǎng)分化得到巨噬細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞。檢測時(shí)需要對(duì)效應(yīng)細(xì)胞及靶細(xì)胞進(jìn)行免疫標(biāo)記，通過流式細(xì)胞儀等手段探測效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的吞噬作用。該方法變異性大、耗費(fèi)人力、耗時(shí)長，不適合作為質(zhì)量控制方法。相較于傳統(tǒng)的ADCC檢測法，以報(bào)告基因法檢測的產(chǎn)品，主要以輝光型底物為主，加上一管集裂解和反應(yīng)于一體的反應(yīng)液，光穩(wěn)定性好，但光強(qiáng)度一般。