[發明專利]一種基于免疫質譜技術的25羥維生素D快速靈敏分析方法

在審

• 申請號: 202010791477.1
• 申請日: 2020-08-07
• 公開（公告）號: CN111879876A
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 姜寬;祝長城;許海峰
• 申請（專利權）人: 蘇州新波生物技術有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/08;G01N30/14;G01N30/72;G01N33/82;G01N33/53
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 俞滌炯

本發明涉及一種基于免疫質譜技術的25羥維生素D快速靈敏分析方法，步驟包括：S1、富集純化：取樣本，加入同位素內標溶液和生物素化抗體磁珠，并震蕩孵育，孵育后依次用磁珠清洗液和純水洗滌；S2、一步法衍生洗脫：將洗滌后的磁珠加入含4?苯基?1,2,4?三唑啉?3,5?二酮的乙腈溶液，并震蕩孵育進行衍生洗脫，再向衍生洗脫液中加入含CH₃NH₂的水溶液以終止反應；S3、液相色譜?質譜檢測：轉移所述衍生洗脫液至液相色譜?質譜聯用儀檢測。本發明創新性地在樣本維生素D代謝物的洗脫階段發明了一種樣本一步法衍生洗脫的策略，從而提高了免疫?質譜法的分析靈敏度，實現精準的維生素D代謝物定量，且不增加額外的樣本處理時間及步驟。

技術領域

本發明涉及免疫質譜技術領域，尤其涉及一種基于免疫質譜技術的25羥維生素D快速靈敏分析方法。

背景技術

25羥維生素D，即25(OH)D包括25羥維生素D2，即25(OH)D2和25羥維生素D3，即25(OH)D3是維生素D在體內的主要存在形式。生物樣本(如全血、血清、尿液或唾液)中的25(OH)D2和25(OH)D3檢測方法主要包括液相色譜質譜法和免疫分析法。

液相色譜質譜法檢測前，25(OH)D2和25(OH)D3需從生物樣本中富集和分離出來，傳統的樣本處理方法主要包括沉淀法，液液萃取法和固相萃取法，獲得樣本中的物質根據性質不同經液相色譜分離隨后根據質核比不同經質譜檢測分析。液相色譜質譜法可實現25(OH)D2和25(OH)D3的同時檢測。免疫分析法包括放射免疫法(RIA)、酶聯免疫法(ELISA)、化學發光免疫法(CLIA)、電化學發光免疫法(ECLIA)和全自動生化法。其基本原理是利用25(OH)D的抗體特異地捕獲生物樣本中的25(OH)D，然后通過檢測相應的放射量、光或電化學信號，達到分析25(OH)D的目的。但一般25(OH)D2和25(OH)D3均會被抗體捕獲，因而免疫分析法檢測的為總25(OH)D的水平，且非特異性富集易干擾檢測結果。

由于25(OH)D2和25(OH)D3的人體內源水平較低，因而對質譜儀器的檢測靈敏度要求較高，對于大部分臨床質譜平臺，為實現低濃度樣本的精準定量，維生素D代謝物從樣本中提取后還需要進行衍生化，從而提升25(OH)D2和25(OH)D3的分析靈敏度。但該過程需要將提取的樣本干燥和衍生后再稀釋上機，會引入額外的操作步驟，十分費時并增加人工負擔。

因此，亟需一種基于免疫抗體富集純化、一步法衍生洗脫并結合液相色譜-質譜檢測的25(OH)D2和25(OH)D3分析法。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種一種基于免疫質譜技術的25羥維生素D快速靈敏分析方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：

提供一種基于免疫質譜技術的25羥維生素D快速靈敏分析方法，步驟包括：

S1、富集純化：取樣本，加入同位素內標溶液和生物素化抗體磁珠，并震蕩孵育，孵育后依次用磁珠清洗液和純水洗滌；

S2、一步法衍生洗脫：將洗滌后的磁珠加入含4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮的乙腈溶液，并震蕩孵育進行衍生洗脫，再向衍生洗脫液中加入含CH₃NH₂的水溶液以終止反應；

S3、液相色譜-質譜檢測：轉移所述衍生洗脫液至液相色譜-質譜聯用儀檢測；

其中，所述樣本為血清、全血、尿液或體液中的一種；

其中，所述液相色譜-質譜聯用儀采用QSight 210MD液相色譜-三重四極桿質譜系統；