[發(fā)明專利]一種產(chǎn)L-賴氨酸的重組菌株及其構(gòu)建方法與應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010790868.1
• 申請日: 2020-08-07
• 公開（公告）號: CN111979164B
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發(fā)明（設計）人: 魏愛英;孟剛;賈慧萍;周曉群;馬風勇;趙春光;田斌;郭小煒
• 申請（專利權(quán)）人: 寧夏伊品生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/08;C12R1/15
• 代理公司: 北京知元同創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11535
• 代理人: 田芳

本發(fā)明提供一種對谷氨酸棒桿菌中NCgl1089基因編碼序列引入點突變或改善其表達的方法，所述方法可以使帶有所述突變的菌株提高L?賴氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量。所述點突變是使NCgl1089基因序列第508位堿基由鳥嘌呤(G)突變?yōu)橄汆堰?A)，使編碼的相應氨基酸序列第170位谷氨酸(E)被賴氨酸(K)所取代。

技術(shù)領域

本發(fā)明屬于基因工程和微生物技術(shù)領域，具體涉及一種具有增強的L-賴氨酸生產(chǎn)能力的棒桿菌屬的菌株及其構(gòu)建方法與應用。

背景技術(shù)

L-賴氨酸具有促進發(fā)育、增強免疫力和提高中樞神經(jīng)組織功能等生理功效，是人體和動物不能自身合成且生長必需的8種基本氨基酸之一。目前，L-賴氨酸是世界上的第二大氨基酸品種，主要生產(chǎn)方法是發(fā)酵法，其中谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)等是賴氨酸的重要生產(chǎn)菌株。L-賴氨酸工業(yè)產(chǎn)量的約90％用作飼料工業(yè)中的營養(yǎng)強化劑，10％用作食品工業(yè)中的鮮味劑和甜味劑，以及醫(yī)藥行業(yè)中的藥物中間體。

對發(fā)酵法生產(chǎn)L-賴氨酸的改進可以涉及發(fā)酵技術(shù)如攪拌和供應氧氣；或涉及營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成，例如發(fā)酵過程中的糖濃度；或涉及將發(fā)酵液加工成合適的產(chǎn)品形式，例如通過干燥和造粒發(fā)酵液或離子交換色譜；或可以涉及相關微生物本身的固有性能性質(zhì)。

用于改善這些微生物的性能性質(zhì)的方法包括是誘變、突變體的選擇和篩選。以這種方式獲得的菌株對抗代謝物具有抗性或?qū)τ诰哂姓{(diào)節(jié)重要性的代謝物是營養(yǎng)缺陷型并產(chǎn)生L-賴氨酸。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了生成L-賴氨酸的屬于棒桿菌屬的微生物，其中編碼SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的表達改善。本發(fā)明還提供了通過使用所述微生物生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。

本發(fā)明的第一個方面提供了生成L-賴氨酸的屬于棒桿菌屬的微生物，其具有編碼SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表達。根據(jù)本發(fā)明，所述改善的表達是所述多核苷酸表達增強，或者編碼SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有點突變，或者編碼SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有點突變且表達是增強的。

所述SEQ ID NO:3的氨基酸序列是基因NCgl1089編碼的蛋白。

所述微生物與野生型或親本菌株相比具有增強的L-賴氨酸生產(chǎn)能力。

所述多核苷酸可以編碼與SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有約90％或更高、約92％或更高、約95％或更高、約97％或更高、約98％或更高、或約99％或更高的序列同源性的氨基酸序列。如本文中使用的，術(shù)語“同源性”指兩種多核苷酸或兩種多肽模塊之間的百分比同一性?？梢酝ㄟ^使用本領域中已知的方法測定一種模塊和另一種模塊之間的序列同源性。例如，可以通過BLAST算法測定此類序列同源性。

可以如下增強多核苷酸的表達：通過取代或突變表達調(diào)節(jié)序列、對多核苷酸序列引入突變、通過經(jīng)由染色體插入或載體導入的多核苷酸拷貝數(shù)的增加、或其組合等。

可以修飾多核苷酸的表達調(diào)節(jié)序列。表達調(diào)節(jié)序列控制與其可操作連接的多核苷酸的表達，并且例如可以包括啟動子、終止子、增強子、沉默子等。多核苷酸可以具有起始密碼子的變化。可以將多核苷酸摻入染色體的特定位點中，從而增加拷貝數(shù)。在本文，特定的位點可以包括例如轉(zhuǎn)座子位點或基因間位點。另外，可以將多核苷酸摻入表達載體中，將所述表達載體導入宿主細胞中，從而增加拷貝數(shù)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，通過將多核苷酸或者具有點突變的多核苷酸摻入微生物染色體的特定位點中，從而增加拷貝數(shù)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，通過將帶有啟動子序列的多核苷酸或者帶有啟動子序列的具有點突變的多核苷酸摻入微生物染色體的特定位點中，從而過表達所述核酸序列。

在本發(fā)明的一種實施方式中，將多核苷酸或者具有點突變的多核苷酸摻入表達載體中，將所述表達載體導入宿主細胞中，從而增加拷貝數(shù)。