[發明專利]一種檢測早期老年癡呆癥的免疫組化試劑盒及其使用方法

在審

• 申請號: 202010785283.0
• 申請日: 2020-08-06
• 公開（公告）號: CN112540178A
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發明（設計）人: 王小川;王喆;曾寬;吳剛
• 申請（專利權）人: 武漢天德生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N33/577;G01N33/558
• 代理公司: 武漢藍寶石專利代理事務所(特殊普通合伙) 42242
• 代理人: 陳琳

1.一種檢測早期老年癡呆癥的免疫組化試劑盒，其特征在于，包括以下試劑：

試劑A：APOE4點突變單克隆抗體，

試劑B：HRP標記的二抗工作液，

試劑C：過氧化物酶失活劑，

試劑D：聚合物增強劑，

PBST洗滌液，抗原修復液，DAB顯色液及復染工作液；

其中APOE4點突變單克隆抗體重鏈氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，輕鏈氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

2.根據權利要求1所述的檢測早期老年癡呆癥的免疫組化試劑盒，其特征在于，所述APOE4點突變單克隆抗體由保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號為：CCTCC NO：C2020121的雜交瘤細胞株ACE8產生。

3.根據權利要求1所述的檢測早期老年癡呆癥的免疫組化試劑盒，其特征在于，試劑A為3％BSA-PBST配制的APOE4單克隆抗體液體，濃度為0.2μg/μL。

4.根據權利要求1所述的檢測早期老年癡呆癥的免疫組化試劑盒，其特征在于，試劑B為HRP標記的抗鼠IgG聚合物，濃度為1mg/ml。

5.根據權利要求1所述的檢測早期老年癡呆癥的免疫組化試劑盒，其特征在于，試劑C過氧化物酶失活劑為3％H₂O₂-甲醇溶液。

6.根據權利要求1所述的檢測早期老年癡呆癥的免疫組化試劑盒，其特征在于，試劑D中的聚合物增強劑為PEG4000。

7.根據權利要求1所述的檢測早期老年癡呆癥的免疫組化試劑盒，其特征在于，所述PBST洗滌液為含有體積百分比為0.01％Tween-20的0.01mol/L PBS緩沖液。

8.根據權利要求1所述的檢測早期老年癡呆癥的免疫組化試劑盒，其特征在于，所述抗原修復液為10mmol/L的枸櫞酸鹽緩沖液，pH6.0。

9.權利要求1-8任一項所述的檢測早期老年癡呆癥的免疫組化試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)組織切片脫蠟和水化：二甲苯5min×2次→無水乙醇5min×1次→95％乙醇5min×1次→80％乙醇5min→70％乙醇5min→自來水沖洗片刻→PBST洗滌液沖洗1min×3次；

(2)抗原修復：壓力鍋中加入足以淹沒切片的抗原修復液，加熱至沸騰，放入切片，扣上壓力閥，繼續加熱至噴氣，維持1.5min，取出自然冷卻至室溫；

(3)洗滌：ddH₂O浸泡5分鐘，清洗2次，PBST洗滌液浸泡5分鐘，清洗2次；

(4)滅活酶：每片滴加試劑C酶失活劑工作液，室溫處理15min；

(5)洗滌：PBST洗滌液浸泡5分鐘，清洗3次；

(6)加一抗：加入試劑A，37℃，濕盒中孵育1小時；

(7)洗滌；PBST洗滌液浸泡5分鐘，清洗3次；

(8)加聚合物增強劑：加入試劑D聚合物增強劑50μl，濕盒中室溫孵育30分鐘；

(9)洗滌：PBST洗滌液浸泡5分鐘，清洗3次；

(10)加酶標二抗：加入試劑B HRP標記的抗鼠IgG聚合物二抗工作液，室溫37℃，孵育30分鐘；

(11)洗滌：PBST洗滌液浸泡5分鐘，清洗3次；

(12)顯色：每張切片滴加100μl DAB顯色液，同時在顯微鏡下觀察控制顯色程度，待出現陽性反應，則置流水下沖洗及時終止反應；

(13)復染：將切片放入復染工作液中，染色30min,用蒸餾水沖洗干凈；1％鹽酸-乙醇分化，流水沖洗；脫水、封片。