[發(fā)明專利]一種糖尿病視網(wǎng)膜病變檢測生物標(biāo)記物、檢測試劑盒及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010784124.9
• 申請(qǐng)日: 2020-08-06
• 公開（公告）號(hào): CN111793683B
• 公開（公告）日: 2021-04-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 顏標(biāo);李秀苗;蔣沁;朱君雅;孫亞男;姚進(jìn);姚牧笛;鐘宇玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6883
• 分類號(hào): C12Q1/6883;C12Q1/6851;C12N15/113
• 代理公司: 北京金智普華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種糖尿病視網(wǎng)膜病變檢測生物標(biāo)記物、檢測試劑盒及應(yīng)用。本發(fā)明利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，通過檢測血清中LncRNA AQP4?AS1的相對(duì)含量，為糖尿病視網(wǎng)膜病變提供了新的檢測標(biāo)記物和預(yù)后評(píng)估方法，本發(fā)明提供的試劑盒具有創(chuàng)傷性小和操作簡單等特點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種糖尿病視網(wǎng)膜病變檢測生物標(biāo)記物、檢測試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，也是主要的致盲性眼病之一，其發(fā)病率逐年增長，現(xiàn)已成為全球公共衛(wèi)生問題和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。DR發(fā)病早期即出現(xiàn)視網(wǎng)膜血管損傷，表現(xiàn)為血視網(wǎng)膜屏障破壞、血管通透性增加、內(nèi)皮細(xì)胞增生、周細(xì)胞丟失、基底膜增厚和新生血管的形成。病程后期可出現(xiàn)玻璃體積血、黃斑缺血水腫、視網(wǎng)膜脫離等并發(fā)癥，從而造成視功能嚴(yán)重受損。

目前，糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療方式主要是激光、藥物和手術(shù)三大類。激光治療包括全視網(wǎng)膜光凝、局部光凝和格柵光凝。局部藥物干預(yù)手段包括糖皮質(zhì)激素治療和玻璃體腔注射抗血管內(nèi)皮生長因子；手術(shù)治療主要為玻璃體切割法。然而，目前這些方法都無法從根本上解決微血管無灌注和缺血缺氧等問題，并且具有治療的局限性和副作用。因此，針對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的診斷和干預(yù)，找到靈敏且應(yīng)用方便的檢測標(biāo)記物，具有十分重要的臨床意義。

長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長度超過200nt的RNA分子，可以在多種層面調(diào)控基因的表達(dá)，如表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。LncRNA參與基因組印記、染色體修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾和核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等多種重要的生理過程。已有大量研究證明，LncRNAs在人類多種疾病中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，包括眼科疾病、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等。鑒于IncRNA的特征和疾病相關(guān)性，其有望成為診斷的標(biāo)志物和預(yù)后評(píng)估的標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種糖尿病視網(wǎng)膜病變檢測生物標(biāo)記物、檢測試劑盒及應(yīng)用，公開了LncRNA AQP4-AS1在正常人和糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清中的表達(dá)情況，包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測LncRNA AQP4-AS1的方法，為糖尿病視網(wǎng)膜病變的診斷和預(yù)后評(píng)估提供了生物學(xué)基礎(chǔ)，目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中的一部分問題或至少緩解現(xiàn)有技術(shù)中的一部分問題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測糖尿病視網(wǎng)膜病變的生物標(biāo)記物，所述標(biāo)記物為LncRNA AQP4-AS1，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

進(jìn)一步地，所述標(biāo)記物的檢測引物如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

一種糖尿病視網(wǎng)膜病變實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于：包括PCR擴(kuò)增體系，所述PCR擴(kuò)增體系包括SYBR Premix Ex Taq 2×(包括Ex Taq酶，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，TB Green)100μL，AQP4-AS1特異性的qRT-PCR上游引物，1管，10μM，100μL/管，AQP4-AS1特異性的qRT-PCR下游引物，1管，10μM，100μL/管，GAPDH定量PCR上游引物，1管，10μM，100μL/管，GAPDH定量PCR下游引物，1管，10μM，100μL/管。

進(jìn)一步地，所述AQP4-AS1特異性的qRT-PCR上游引物如SEQ ID NO:4所示，下游引物如SEQ ID NO:5所示；GAPDH定量PCR上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。RNA反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物為GAPDH定量PCR引物序列。

進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括總RNA反轉(zhuǎn)錄引物(包括Oligo dT和Random 6mers)，1管，濃度：50μM，50μL/管，反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μL)50μL，dNTP Mixture(10mM each)50μL，反轉(zhuǎn)錄buffer 50μL。