[發明專利]一種以SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD區為抗原的納米疫苗及其制備

在審

• 申請號: 202010783722.4
• 申請日: 2020-08-06
• 公開（公告）號: CN112023035A
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發明（設計）人: 劉龍丁;李恒;郭磊;鄭惠文;梁燕;楊澤寧;陳燕麗;和占龍;施海晶;李菁
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所
• 主分類號: A61K39/215
• 分類號: A61K39/215;A61P31/14;C12N15/85;C12N15/50
• 代理公司: 昆明協立知識產權代理事務所(普通合伙) 53108
• 代理人: 謝嘉

1.一種以SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD區為抗原的納米疫苗，其特征在于：該疫苗是一種表達SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD區氨基酸序列的蛋白，其單體氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示，在細胞內24個單體能自組裝成球體結構，并且融合表達的SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD肽段展示在球體表面。

2.制備權利要求1所述納米疫苗的方法，具體包括以下步驟：

(1)將帶有SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD區基因序列的表達載體轉染進293T、293i、CHO細胞系中進行抗體表達，所述的SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD區基因序列如序列表SEQ ID NO.2所示；其中，293T細胞表達體系使用無血清培養基，轉染試劑為FuGENE HD Transfection(Promega)；293i和CHO細胞表達體系為懸浮表達系統，使用無血清培養基，轉染試劑為PEI25000；其余操作按照293T、293i和CHO細胞表達體系的常規操作方法進行；

(2)使用非變性提取方法包括研磨、凍融和超聲方法提取細胞中蛋白；培養基直接超濾富集；

(3)Ni-NTA柱進行抗體的親和層析純化，并收集純化后的蛋白；其中，洗脫時使用梯度洗脫方法，基礎緩沖液組成為50mM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，0.05％吐溫20和5％甘油，pH7.5；洗脫緩沖液由基礎緩沖液加入不同濃度的咪唑配制；梯度洗脫方法為使用10mM，20mM和40mM咪唑的洗脫緩沖液依次洗脫至無蛋白流出，然后依次使用200mM和300mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫，并收集200mM和300mM咪唑的洗脫緩沖液，富集收集的200mM和300mM咪唑的洗脫緩沖液；

(4)純化后的蛋白使用pH 7.5的2mM PBS進行過夜透析，透析后蛋白檢測濃度備用；

(5)將目的蛋白總量與終濃度為1mg/ml的氫氧化鋁佐劑混合孵育2h以上，形成穩定的混合物即為所需的納米自組裝顆粒蛋白疫苗。