[發(fā)明專利]一種共表達羥基類固醇脫氫酶的發(fā)酵工藝

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010779952.3
• 申請日: 2020-08-05
• 公開（公告）號: CN111676202B
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發(fā)明（設計）人: 趙志斌;程雷;王丹丹;丁峰;張?zhí)K敏;羅德彬
• 申請（專利權）人: 重慶極澤生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N1/21;C12N1/38;C12R1/19
• 代理公司: 重慶強大凱創(chuàng)專利代理事務所(普通合伙) 50217
• 代理人: 陳雍

1.一種羥基類固醇脫氫酶的工業(yè)發(fā)酵工藝，其特征在于，包括以下依次進行的步驟：

搖瓶種子制備步驟：使用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)重組酶菌株兩次，獲得用于發(fā)酵擴增步驟的待擴增工程菌；所述重組酶菌株為表達7α-HSDH的工程菌或者表達7β-HSDH的工程菌；7α-HSDH的蛋白序列如SEQ?ID?NO:2所示，7β-HSDH的蛋白序列如SEQ?ID?NO:6所示；

發(fā)酵擴增步驟：包括一級發(fā)酵培養(yǎng)、二級發(fā)酵培養(yǎng)和三級發(fā)酵培養(yǎng)；在三級發(fā)酵培養(yǎng)中，培養(yǎng)基的成分為酵母提取物5g/L,蛋白胨10g/L,氯化鈉6g/L,七水合硫酸鎂0.5g/L，氯化銨1.5g/L，十二水合磷酸氫二鈉8.5g/L，甘油1.5g/L；

培養(yǎng)階段：將經(jīng)發(fā)酵擴增的工程菌接種于高密度發(fā)酵培養(yǎng)基中，獲得體積為10000L-30000L的發(fā)酵系統(tǒng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度37℃、攪拌速度100-200rpm、通氣量5000-30000L/min、pH?6.0-7.0、溶解氧20％-80％，培養(yǎng)3-5h，培養(yǎng)至發(fā)酵液的OD₆₀₀值為10-15，獲得發(fā)酵系統(tǒng)Ⅰ；所述高密度發(fā)酵培養(yǎng)基包括基礎成分和微量元素成分；所述基礎成分包括：酵母提取物1.75-4.00g/L，蛋白胨3.5-8.0g/L，七水合硫酸鎂1.5-2.5g/L，磷酸二氫鉀2.5-4.0g/L，氯化銨4.5-8.0g/L，十二水合磷酸氫二鈉10.0-15.0g/L，甘油12.5-25.0g/L；所述微量元素成分包括：六水合氯化鈣0.01-0.08g/L，四水合氯化亞錳0.01-0.10g/L，六水合氯化鐵0.01-0.10g/L；

補料階段：所述發(fā)酵系統(tǒng)的體積用V表示，單位為L；初始培養(yǎng)條件為：以6.0V-7.5Vml/h的速度向發(fā)酵系統(tǒng)Ⅰ連續(xù)流加補料培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度37℃、攪拌速度100-200rpm、通氣量5000-30000L/min、pH?6.0-7.0、溶解氧5％-30％，培養(yǎng)至發(fā)酵液的OD₆₀₀值為15-25；然后調(diào)整補料培養(yǎng)基的流加速度為4.5V-7.5V?ml/h，以及調(diào)整培養(yǎng)溫度為20-25℃，培養(yǎng)至發(fā)酵液的OD₆₀₀值為25-35，獲得發(fā)酵系統(tǒng)Ⅱ；

乳糖誘導階段：向發(fā)酵系統(tǒng)Ⅱ中以4.5V-7.5V?ml/h的速度流加補料培養(yǎng)基，并維持乳糖濃度為8-15g/L；乳糖誘導階段的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度20-30℃、攪拌速度100-200rpm、通氣量5000-30000L/min、pH?6.0-7.0、溶解氧5％-30％；誘導20h，OD₆₀₀值達到100-150，停止發(fā)酵；以50-500L/h的速度向發(fā)酵系統(tǒng)Ⅱ流加乳糖誘導劑，并在5h內(nèi)使乳糖濃度達到8-15g/L，然后維持乳糖濃度為8-15g/L；所述補料培養(yǎng)基的成分為：酵母提取物1.75-5.00g/L，蛋白胨3.75-10.0g/L，甘油200-400g/L，七水合硫酸鎂0.25-1.00g/L；所述乳糖誘導劑中乳糖的濃度為200g/L。