[發明專利]一種耐高糖的β-葡萄糖苷酶及其表達基因和應用

在審

• 申請號: 202010778904.2
• 申請日: 2020-08-05
• 公開（公告）號: CN111893108A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 朱艷冰;焦曉佳;李清彪;倪輝;姜澤東;李志朋;陳艷紅;楊遠帆
• 申請（專利權）人: 集美大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/14;C12P19/02;C12R1/19
• 代理公司: 廈門創象知識產權代理有限公司 35232
• 代理人: 王鳳玲;尤懷成

本發明涉及一種耐高糖的β?葡萄糖苷酶及其表達基因和應用，該酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明首次克隆并重組表達了微生物微泡菌ALW1耐高糖β?葡萄糖苷酶的基因。該酶具有好的葡萄糖、半乳糖、木糖耐受性，而且是一種在常溫范圍內保持較好活性的中溫低酸性酶。

技術領域

本發明涉及酶工程技術領域，具體涉及一種耐高糖的β-葡萄糖苷酶及其表達基因和應用。

背景技術

隨著科學技術的發展，能源消耗加快。木質纖維素生物質作為生產乙醇和化學品的可再生資源引起了廣泛關注，然而，木質纖維素生物量的頑固性是木質纖維素轉化成本高的主要原因。

β-葡萄糖苷酶是纖維素酶系統的一個組成部分，這是一個水解纖維素β-1,4鍵的復合酶，它具有三類酶的組成部分：(1)內切葡聚糖酶(酶代碼EC 3.2.1.4)，其作用于纖維素鏈上，催化內鍵的隨機斷裂，從而生成葡萄糖和纖維低聚糖；(2)從多糖還原端和非還原端釋放纖維二糖的纖維二糖水解酶(酶代碼EC 3.2.1.91)和(3)從纖維低聚糖釋放葡萄糖的β-葡萄糖苷酶(纖維二糖酶，代碼EC 3.2.1.21)。由于內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活性通常都受到纖維二糖和短纖維低聚糖的抑制，可見β-葡萄糖苷酶易被葡萄糖等纖維素糖化產物抑制。因此，尋找具有高糖耐量的新型β-葡萄糖苷酶已成為研究熱點。然而，相關技術中的β-葡萄糖苷酶的耐糖譜小，通常僅耐葡萄糖。本發明提出了一種耐糖量高且耐糖譜廣的β-葡萄糖苷酶。

發明內容

本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。

為此，在本發明的第一方面，本發明提出了一種耐高糖的β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，該酶包括472個氨基酸，無信號肽序列；其具有好的葡萄糖、半乳糖、木糖耐受性，而且是一種在常溫范圍內保持較好活性的中溫低酸性酶；其最適pH為4.5，在4.0-6.0的范圍內維持1h左右的酶活性約65％，最適溫度為40℃，在25-45℃仍具有50％以上的相對酶活力。當以pNPG為底物時，葡萄糖、D-(+)-半乳糖和D-(+)-木糖可促進該酶的活性。在800mM葡萄糖中，該酶的相對活性達到175％，在1000mM D-(+)-木糖中達到127％，在600mMD-(+)-半乳糖中達到123％。

在本發明的第二方面，本發明提出了一種編碼上述的耐高糖的β-葡萄糖苷酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。基因包含一個開放的1419個堿基對，編碼472個氨基酸殘基的蛋白質。

在本發明的第三方面，本發明提出了一種含有上述β-葡萄糖苷酶基因的重組載體。

在本發明的第四方面，本發明提出了一種由上述重組載體轉化宿主得到的重組工程菌。其中，所述宿主體為大腸桿菌細胞。

在本發明的第五方面，本發明提出了一種制備耐高糖的β-葡萄糖苷酶的方法，其包括構建含上述的β-葡萄糖苷酶基因的重組載體；將所述重組載體轉化至宿主體內，以便獲得重組工程菌；將所述重組工程菌進行誘導培養，從培養液中獲得耐高糖的β-葡萄糖苷酶。

在本發明的第六方面，本發明提出了上述的β-葡萄糖苷酶在纖維素降解中的應用。

本發明首次克隆并重組表達了微生物微泡菌ALW1耐高糖β-葡萄糖苷酶的基因。該酶可減少葡萄糖和纖維二糖在纖維素糖化過程中產生的抑制作用，從而降低木質纖維素生物質生產乙醇和化學品等生物燃料的生產成本。

本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。

附圖說明

圖1為根據本發明實施例的β-葡萄糖苷酶MGlu1A的SDS-PAGE分析；

圖2為根據本發明實施例的β-葡萄糖苷酶MGlu1A的最適pH；