[發(fā)明專利]一種檢測腫瘤患者尿液生物標(biāo)志物的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010776867.1
• 申請日: 2020-08-05
• 公開（公告）號: CN112094886A
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王衛(wèi);唐凱;李欣
• 申請（專利權(quán)）人: 青島科技大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34;G01N21/64;C08L5/08;C08L71/02;C08K9/12;B82Y30/00
• 代理公司: 青島中天匯智知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37241
• 代理人: 袁曉玲

透明質(zhì)酸酶HAase與許多惡性腫瘤密切相關(guān)。研究表明，HAase濃度在膀胱癌患者的尿液中顯著增高，使其成為膀胱癌早期診斷與治療的重要生物標(biāo)志物之一。本發(fā)明提出了一種采用空心金納米材料構(gòu)建基于HAase?HA生物識別作用的納米復(fù)合材料進行自催化循環(huán)放大反應(yīng)用于檢測HAase的方法。該方法不但使檢測體系得到優(yōu)化和改進，而且，最大程度地提高了檢測靈敏度、簡化了檢測過程、降低了檢測成本、拓寬了應(yīng)用領(lǐng)域，解決了活體、細(xì)胞成像技術(shù)復(fù)雜、價格居高、靈敏度不足等難題，尤為重要的是，本發(fā)明無需采用任何工具酶就能獲得信號的循環(huán)放大效果，為體內(nèi)外檢測、活體及細(xì)胞成像等領(lǐng)域提供新的技術(shù)和方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及腫瘤患者尿液生物標(biāo)志物的檢測，具體涉及一種檢測腫瘤患者尿液生物標(biāo)志物透明質(zhì)酸酶HAase的方法，屬于光電化學(xué)生物傳感分析及生物醫(yī)學(xué)臨床診斷領(lǐng)域。

背景技術(shù)

膀胱癌是男性泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均占泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤的首位。由于傳統(tǒng)的膀胱癌臨床診斷方法多以膀胱鏡檢查為主，不但存在創(chuàng)傷和痛苦，對于臨床早期診斷也明顯不足。據(jù)報道，透明質(zhì)酸酶HAase與許多惡性腫瘤密切相關(guān)，該酶是由Frost在1997年首先分離純化得到。研究表明，HAase的表達水平在癌細(xì)胞中大大增加，而在正常細(xì)胞中的分布較少。特別是，HAase濃度在膀胱癌患者的尿液中顯著增高，使其成為膀胱癌早期診斷與治療的重要生物標(biāo)志物之一。作為一種膀胱癌腫瘤標(biāo)志物，HAase具備蛋白水解酶的特性，能夠通過特異性地切割透明質(zhì)酸HA結(jié)構(gòu)內(nèi)部β-N-乙酰基-D-葡萄糖胺鍵來降解HA。除此之外，HAase還與廣泛的生理和病理過程有關(guān)，包括受精、胚胎發(fā)生、炎癥和腫瘤生長，除膀胱癌之外，其過表達已被報道與許多惡性腫瘤相關(guān)，包括前列腺癌、腦癌、結(jié)腸癌等多種癌癥，日益成為一種重要的腫瘤標(biāo)志物而得到廣泛關(guān)注和研究。因此，開發(fā)靈敏檢測HAase的技術(shù)對于腫瘤的早期診斷和治療具有重要意義。但是，傳統(tǒng)的檢測方法，例如粘度測定法，比濁法，比色法和酶譜法等通常缺乏靈敏度和選擇性。而免疫測定法因其昂貴的抗體和繁瑣的檢測步驟限制了它的實際應(yīng)用。與其他方法相比，熒光檢測技術(shù)因其具有操作簡便、靈敏度高、實時監(jiān)測能力強、適合于高通量檢測等優(yōu)點得到廣泛研究。因此，為了克服傳統(tǒng)技術(shù)的缺點和不足，迫切需要開發(fā)出既無創(chuàng)傷、無痛苦、又簡單、靈敏、特異及準(zhǔn)確度高的熒光檢測方法來滿足生物醫(yī)療領(lǐng)域?qū)Π螂装┑榷喾N相關(guān)癌癥的早期診斷及早期治療的需求。

本發(fā)明根據(jù)HAase能夠特異性地切割并降解HA的這一特性，利用HA作為生物識別分子，采用細(xì)胞毒性低、生物相容性好的金納米材料載帶信號分子，通過表面組裝方法將生物識別分子與載有信號分子的納米載體組裝為一體，構(gòu)建形成具有生物識別作用的熒光納米金復(fù)合材料。為了獲得比傳統(tǒng)技術(shù)更高的靈敏度和特異性，本發(fā)明采用具有特殊結(jié)構(gòu)的多孔金納米材料用于熒光信號分子的載帶，即將信號分子負(fù)載于空心金納米材料中，為了抑制信號分子的泄露而產(chǎn)生假陽性信號，通過簡單有效的表面修飾技術(shù)將生物識別分子組裝到納米材料表面，使得納米金表面被生物識別分子包被，起到分子鎖的作用，有效抑制了信號分子的泄露，從而構(gòu)建獲得了基于HAase-HA生物識別作用的熒光納米復(fù)合材料。利用構(gòu)建獲得的熒光納米復(fù)合材料，可實現(xiàn)對HAase的高靈敏檢測。

基于該檢測機理，不但實現(xiàn)了生物識別分子對于靶標(biāo)的特異性識別和響應(yīng)，釋放出大量的信號分子從而獲得顯著增強的熒光信號，而且由于HAase的特性，靶標(biāo)可以被循環(huán)利用，因此，即便很微量的HAase，也能夠通過不斷地剪切-循環(huán)-再剪切的循環(huán)方式打開更多的分子鎖，不斷釋放出更多的信號分子，使熒光信號呈指數(shù)型增強，最終實現(xiàn)靶標(biāo)的超靈敏檢測。在該體系中，熒光信號的循環(huán)放大無需外加生物酶進行催化，而靶標(biāo)分子HAase通過與HA構(gòu)建的分子鎖發(fā)生生物識別作用的同時就可以依靠自身啟動催化循環(huán)反應(yīng)，使更多的分子鎖被打開，不斷釋放出大量的信號分子，因此，該體系的檢測策略是基于生物識別的自催化反應(yīng)，使HAase得到循環(huán)利用，最終使檢測信號得到循環(huán)放大，為HAase的高靈敏檢測提供了特異、高效的自催化循環(huán)放大檢測技術(shù)。迄今為止，利用空心金納米材料構(gòu)建基于HAase-HA生物識別作用的納米復(fù)合材料進行自催化循環(huán)放大反應(yīng)用于HAase檢測的文獻還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容