[發明專利]一種星孢菌素產生菌的選育及制備方法

在審

• 申請號: 202010776428.0
• 申請日: 2020-08-05
• 公開（公告）號: CN111793618A
• 公開（公告）日: 2020-10-20
• 發明（設計）人: 黃志強;林青平;曾建華
• 申請（專利權）人: 廣東新達瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12N13/00;C12N1/20;C12P17/18;C12R1/465
• 代理公司: 福州市鼓樓區年盛知識產權代理事務所(普通合伙) 35254
• 代理人: 吳小波

1.一種星孢菌素產生菌的選育，其特征在于，包括以下步驟：

(1)菌種紫外誘變選育：采用15KW紫外燈，調整照射距離為15～20cm，照射前開啟紫外燈預熱30分鐘，取50ul孢子懸液加入固態培養基平皿中，用三角涂布棒均勻涂開，打開平皿蓋，分別照射0s、5s、10s、15s、20s、25s、30s，放置28℃暗箱中倒置培養5～8天，采用連續多次誘變的方法，在每次誘變之后選擇3～5株較好的菌株繼續誘變，挑選經過連續10次紫外誘變處理后的單菌落5株，進行搖瓶發酵；

(2)星孢菌素HPLC檢測：通過HPLC檢測發酵液中星孢菌素的含量，篩選出高產星孢菌素菌號：鏈霉菌XDR-UV-10-3。

2.根據權利要求1所述的一種星孢菌素產生菌的選育，其特征在于，所述鏈霉菌XDR-UV-10-3在固體培養基平皿中28℃培養5～8天后，菌落形態圓整，表面凸起，菌落直徑約2～6mm，菌落表面光滑，有溝紋，基質菌絲發達，與培養基結合緊密，不易挑起，顏色呈無色或淡黃色，氣生菌絲白色，產孢豐富，前期白色，后期轉青灰色無可溶性色素。

3.一種星孢菌素產生菌的發酵制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)斜面培養基、種子液培養基、發酵培養基的配制：

斜面培養基(g/l)：麥芽浸粉5，葡萄糖4，酵母浸粉2，瓊脂20，消前pH7.0～7.5，250mL規格的茄形瓶，裝量50mL，經121℃滅菌30分鐘，冷卻至50～60℃左右擺斜面，待冷卻凝固后放37℃培養箱空培1～2天；

種子液培養基(g/L)：花生餅粉10，玉米淀粉5，葡萄糖4，甘油10，酵母粉4，碳酸鈣2，硫酸鎂0.5，磷酸氫二銨0.1，氯化鈉0.1，消前pH7.0～7.5，三角搖瓶裝液量25mL/250mL，121℃滅菌30分鐘。

發酵培養基(g/L)：甘油40，花生餅粉20，葡萄糖5，酵母粉4，碳酸鈣3，硫酸鎂1，硫酸亞鐵0.05，硫酸鋅0.002，消前pH7.0～7.5，三角搖瓶裝液量25mL/250mL，121℃滅菌30分鐘；

(2)斜面培養：接種權利要求1的高產星孢菌素菌即鏈霉菌XDR-UV-10-3至斜面培養基內，28±1℃培養5～8天，得到菌懸液；

(3)種子液培養：接種105～106cfu/ml菌懸液到種子液培養基中，28±1℃，250rpm振蕩培養20～30小時，此時得到種子液pH6.5～7.0，菌絲體菌濃10～15％(V/V)；

(4)選擇搖瓶或30-50-50L三聯罐培養：

A.選擇搖瓶培養：吸取1～2ml種子液接入發酵培養基，培養溫度28±1℃，250rpm轉速振蕩培養100～168小時，得到最終的發酵液；

B.選擇30-50-50L三聯罐培養：①在30L的種子罐中投入15L的步驟(1)中的種子液培養基，用蒸汽滅菌，121℃滅菌30分鐘，待冷卻至28℃后接入一級的搖瓶種子液30mL，攪拌轉速100rpm，通氣量1.0vvm，溫度28±1℃培養20～30小時，此時種子液pH6.5～7.0，菌濃10～15％(V/V)；②配置發酵培養基(g/L)：玉米淀粉4，甘露醇5，棉籽餅粉3，黃豆餅粉3，麥芽浸粉1，甘油60，花生餅粉20，葡萄糖5，酵母粉7，碳酸鈣3，硫酸鎂1，硫酸亞鐵0.05，硫酸鋅0.002，氯化鈷0.002，L-色氨酸2，DL-蛋氨酸1，硫酸銨0.2，磷酸氫二銨0.2，氯化鈉0.1；③發酵罐體積50L，投料體積30L，用蒸汽滅菌，121℃滅菌30分鐘，待冷卻至28℃后接入種子液3L，攪拌轉速200～400rpm，通氣量0.8～1.0vvm，28℃培養120小時，得到最終的發酵液；

(5)通過HPLC方法檢測發酵液中星孢菌素的含量。