[發明專利]一種副溶血性弧菌的熒光定量RPA檢測方法

在審

• 申請號: 202010774157.5
• 申請日: 2020-08-04
• 公開（公告）號: CN111893200A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 叢鋒;蔡蔚游;李根;曾偉偉;朱余軍
• 申請（專利權）人: 廣東省實驗動物監測所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12Q1/06;C12R1/63
• 代理公司: 廣州本諾知識產權代理事務所(普通合伙) 44574
• 代理人: 朱彩霞

1.一種副溶血性弧菌的熒光定量RPA檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：副溶血性弧菌核酸的提取，取副溶血性弧菌標準菌株凍干粉，使用0.2mL生理鹽水溶解菌株凍干粉，涂于血瓊脂平板，37℃培養18h，挑單菌培養，取菌液1mL，3000rpm離心10min，棄掉上清液液，加150μL的PBS懸起，金屬浴99℃煮沸10min，冰浴3min，離心10min，取上清液，獲得即為細菌基因組DNA，存放-80℃保存；

S2：副溶血性弧菌熒光定量RPA引物的設計，通過生物信息學手段，選取副溶血性弧菌種屬特異性基因tlh基因GenBank(MH047288)作為保守區域設計引物；

S3：副溶血性弧菌普通RPA的建立，按照基礎型RAA試劑盒的說明書，配制如下反應體系：依次在含有干粉酶的反應管中加入A buffer 41.5ul、上游引物F(10umol/L)2ul、下游引物R(10umol/L)2ul、DNA模板2ul，在反應管的蓋子上加入B buffer 2.5ul，然后將反應管上下顛倒數次進行混勻，低速離心10秒，立即放置39℃金屬浴鍋中，孵育30min，反應結束后，使用PCR產物純化試劑盒對基礎型RAA產物進行純化，取5ul純化產物進行2％瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像儀觀察電泳結果，確定能擴增出產物為單一條帶，無非特異性擴增和明顯的引物二聚體的引物對組合(F3+R3)后；

S4：副溶血性弧菌熒光定量RPA探針設計，針對F3+R3引物擴增產物序列，設計長度46-52bp的探針，將靠近的2個T堿基分別以熒光基團(i6FAMdT)和猝滅基團(iBHQ1dT)代替，i6FAMdT和iBHQ1dT必須是替換目的基因中相應堿基T，而不是插入，熒光基團和猝滅基團間隔2-4個堿基，選擇一個用THF代替，THF之前不能少于30個堿基，THF之后15個堿基左右，3'末端標記一個修飾基團，例如C3-spacer，探針序列和引物識別位點不能重疊，避免回文序列、內部二級結構和連續的重復堿基；

S5:副溶血性弧菌熒光定量RPA靈敏度試驗，取S1中所得核酸，用10倍比例稀釋用做模板進行熒光RPA檢測，模板濃度從3×102ng·uL-1～3×10-3ng·uL-1，共6個梯度，參照熒光型RAA試劑盒的說明書，實驗ddH2O做空白對照，以確定建立的方法的靈敏度。

2.根據權利要求1所述的一種副溶血性弧菌的熒光定量RPA檢測方法，其特征在于，所述S2中副溶血性弧菌RPA引物序列表如下所示：

3.根據權利要求1所述的一種副溶血性弧菌的熒光定量RPA檢測方法，其特征在于，所述S4中設計出的探針序列如下所示：