[發明專利]一種泰樂菌素還原酶突變體及其用途

有效

• 申請號: 202010772169.4
• 申請日: 2020-08-04
• 公開（公告）號: CN111925999B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發明（設計）人: 蘇建宇;岳思君;劉永衡;朱慧
• 申請（專利權）人: 寧夏大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/76;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/62;C12R1/54;C12R1/19
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 郭曉迪

本發明提供了一種泰樂菌素還原酶突變體，其是對泰樂菌素還原酶基因第640?642位堿基進行定點突變，使之形成終止密碼子，突變菌株合成泰樂菌素還原酶蛋白時，肽鏈延伸至第213位氨基酸時終止，形成只包含一個結構域的不完整酶蛋白。本發明突變體在保留該酶部分活性的同時，顯著降低其對泰樂菌素的還原活性，從而顯著降低了發酵產物中雷洛霉素的含量，提高了泰樂菌素有效成分的積累水平，同時又不影響弗氏鏈霉菌的正常生長，最終提升了泰樂菌素的產品質量。

技術領域

本發明屬于生物化學與分子生物學領域，具體涉及一種泰樂菌素還原酶突變體及其用途。

背景技術

泰樂菌素是廣泛應用于獸藥及飼料添加劑的獸用抗生素，工業生產中主要采用弗氏鏈霉菌作為生產菌株。泰樂菌素主要由泰樂菌素A(tylosin)、脫碳霉糖泰樂菌素B(desmycosin)、大菌素C(macrocin)和雷洛菌素D(relomycin)4種組分構成，其中泰樂菌素A是最主要的活性組分，因此泰樂菌素A的含量是衡量泰樂菌素發酵產品的標準，實際生產中要求泰樂菌素4種組分含量必須大于95％，其中泰樂菌素A必須達到80％以上。由于發酵生產中泰樂菌素高水平的積累容易導致部分泰樂菌素A轉化為雷洛菌素D，因此最終降低了泰樂菌素產品的質量。

泰樂菌素還原酶(Tylosin reductase)是催化泰樂菌素A組分還原為雷洛菌素D組分的酶。泰樂菌素還原酶以NAD為輔酶，屬醛酮還原酶超家族，該酶含有一個996個核苷酸的開放閱讀框，由331個氨基酸殘基構成，包括兩個蛋白結構域。雖然敲除泰樂菌素還原酶基因可以終止泰樂菌素A轉化為雷洛菌素的還原過程，但同時弗氏鏈霉菌的正常生長也受到影響，致使這種基因敲除菌株不具有生產價值。

發明內容

針對現有技術不足，本發明旨在提供一種泰樂菌素還原酶突變體及其用途，利用定點突變技術來對泰樂菌素還原酶的基因序列進行改造，從而降低泰樂菌素還原酶的活性，進而降低泰樂菌素還原活性，提高泰樂菌素產品的質量。

本發明目的之一是提供一種能夠降低泰樂菌素還原活性的泰樂菌素還原酶突變體。所述泰樂菌素還原酶突變體的氨基酸序列是由如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第214位的色氨酸突變為終止子得到的氨基酸序列。

優選地，所述泰樂菌素還原酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本發明目的之二是提供所述泰樂菌素還原酶突變體的編碼基因。所述編碼基因是由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的第640-642位的堿基TGG替換為TGA、TAG或TAA，最終形成相應的終止密碼子UGA、UAG或UAA。

優選地，所述泰樂菌素還原酶突變體的編碼基因如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示。

本發明目的之三是提供所述泰樂菌素還原酶突變體催化泰樂菌素A還原為雷洛菌素的用途。

本發明目的之四是提供所述泰樂菌素還原酶突變體在降低對泰樂菌素還原活性中的用途。

本發明目的之五是提供包含所述泰樂菌素還原酶突變體的重組載體或宿主細胞。

優選地，所述宿主細胞為大腸桿菌。

優選地，所述宿主細胞為弗氏鏈霉菌。

本發明目的之六是提供所述重組載體或宿主細胞制備泰樂菌素的用途。

本發明目的之七是提供所述泰樂菌素還原酶突變體的制備方法，對包含所述泰樂菌素還原酶突變體的宿主細胞進行培養，當發酵液OD₆₀₀達到0.6時，添加0.5mM誘導劑IPTG，并從培養物中分離純化泰樂菌素還原酶突變體。