[發明專利]轉基因大豆WYN001GmC轉化事件外源插入載體旁側序列及其應用

有效

• 申請號: 202010767927.3
• 申請日: 2020-08-03
• 公開（公告）號: CN111961741B
• 公開（公告）日: 2022-02-15
• 發明（設計）人: 何軍光;翁嘉慧;蔣紅葉;苗昱婷;樓億圓;王云鈴;趙振寧;周駿;費月新;陸建明
• 申請（專利權）人: 浙江新安化工集團股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 溫可睿

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及轉基因大豆WYN001GmC轉化事件外源插入載體旁側序列及其應用。本發明提供了轉基因大豆WYN001GmC轉化事件外源插入載體左側翼序列(如SEQ ID NO:2所示)和右側翼序列(如SEQ ID NO:3所示)及其在檢測轉基因大豆中的應用，可以快速、高效、特異性地檢測待測樣品是否源自上述轉基因大豆，在轉基因大豆的檢測以及種質資源的鑒定方面具有重要意義和廣泛的應用前景。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及轉基因大豆WYN001GmC轉化事件外源插入載體旁側序列及其應用。

背景技術

大豆起源于中國，含豐富植物蛋白，是重要糧食作物之一。2013年～2017 年中國大豆進口量逐漸增長，2017年中國大豆進口量達9 553萬t，同比增長 13.8％；2013年～2017年中國大豆進口量增長3 215萬t，年均復合增長率達 10.8％。2018年受貿易戰影響，1月至11月中國大豆進口量為8 231萬t，同比下降4.3％，但仍然是中國大豆產量的5.4倍。在大豆供需矛盾日益嚴重的形勢下，轉基因技術己成為大豆新品種培育的重要手段。根據2016年國際農業生物技術應用服務組織(ISAAA)發布的報告，自1996年美國孟山都公司研制的抗草甘膦(glyphosate_resistant，GR)轉基因大豆被批準商業化以來，全球轉基因大豆種植面積逐年上升，至2016年達到9140萬hm²，占全球大豆總面積的78％，占全球轉基因作物總種植面積的一半?？钩輨┳魑锏膭撝剖墙r業生物技術中最活躍、最具成效的領域，抗草甘膦作物則是抗除草劑作物中的核心，其中抗草甘膦轉基因大豆居于首位。

目前，已經產業化的抗草甘膦轉基因作物幾乎全部為轉農桿菌基因，應用最廣泛的為CP4 EPSPS基因，CP4 EPSPS基因是孟山都公司克隆的并在1994 年申請了相關專利，2014年過期。第一代抗草甘膦轉CP4 EPSPS基因大豆 GTS40-3-2是國際上應用時間最長、種植面積最大的轉基因作物。來自于土壤農桿菌CP4菌株的CP4 EPSPS基因編碼產生的CP4 5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(CP4 EPSPS蛋白)與植物內源性EPSPS蛋白相比，對草甘膦的親合力大大降低，在草甘膦存在的條件下保證了植物對芳香氨基酸的合成。米氏動力學分析表明CP4 EPSPS對草甘膦有很好的耐受作用(appK1＝2.7mM)，對底物PEP具有很好的結合能力(appKm＝12μM)(轉cp4 epsps基因抗草甘膦大豆 NK603進口用作加工原料的安全證書)。經過多年應用實踐證明其抗性效果較好。CP4EPSPS與植物內源的EPSPS蛋白同源，與已知毒素、過敏原和對人類健康有不良影響的活性蛋白沒有同源性，在模擬胃腸消化液中可以迅速降解，且對熱處理不穩定，在喂養鵪鶉毒理學研究試驗中未表現出毒性，該蛋白家族成員在自然界中廣泛分布，人類對該家族蛋白具有長期的安全食用歷史。

轉基因作物關乎人體健康和生態環境，對轉基因作物進行安全評價十分重要。外源基因的整合位點是其中的一個重要評價部分，外源基因的整合位點，不僅對該基因的轉錄、表達以及調控有重要影響，而且對該作物的遺傳穩定性和安全性也具有重要意義。由于每一個轉基因生物品系外源T-DNA與植物基因組的連接區域都具有特異性，品系特異性檢測方法具有非常高的特異性和準確性。核酸檢測方法，如聚合酶鏈式反應(PCR)或利用多聚核酸探針的DNA雜交方法都可以檢測是否含有轉基因。這些檢測方法一般都關注常用的轉基因元件，如啟動子，終止子，標記基因等，但對于辨別不同的轉化事件是無效的，特別是使用同一個DNA載體的轉化事件更是無法分析，除非插入轉基因附近的染色體DNA序列(旁側DNA)是已知的。因此基于轉基因事件中外源T-DNA整合位點旁側序列建立的特異性檢測方法是實現對該轉基因事件及其衍生品種的有效監督管理、保障轉基因產業健康發展的重要技術手段。本發明提供了轉基因大豆轉化事件外源插入載體左側翼序列和右側翼序列及其在檢測轉基因大豆中的應用，在轉基因大豆的檢測以及種質資源的鑒定方面具有重要意義和廣泛的應用前景。

發明內容