[發明專利]一種保留天然羥基磷灰石的脫細胞骨基質水凝膠及其制備方法

有效

• 申請號: 202010763854.0
• 申請日: 2020-08-01
• 公開（公告）號: CN111905146B
• 公開（公告）日: 2021-11-16
• 發明（設計）人: 蔡晴;左大為;易蜜;楊小平
• 申請（專利權）人: 北京歐亞鉑瑞科技有限公司
• 主分類號: A61L27/12
• 分類號: A61L27/12;A61L27/20;A61L27/24;A61L27/36;A61L27/50;A61L27/52;A61L27/54;A61L27/58
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1.一種保留天然羥基磷灰石的脫細胞骨基質水凝膠，其特征在于：所述水凝膠含有天然骨組織細胞外基質的羥基磷灰石、膠原、糖胺聚糖以及成骨生物活性因子；所述水凝膠中保留的羥基磷灰石含量≤60 wt%。

2.一種權利要求1所述的保留天然羥基磷灰石的脫細胞骨基質水凝膠的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

a.選用同種或異種來源的骨組織，用水反復沖洗去除骨髓，冷凍干燥、粉碎、篩分得到粒徑小于1 mm的骨粉，骨粉滅菌處理后用PBS緩沖液洗滌1~6 h；

b.用體積比為1:0.5-2的氯仿和甲醇混合液浸泡步驟a處理得到的骨粉1-3 h后，用PBS緩沖液洗滌；再用pH 7.4 10 mM Tris-HCl緩沖液浸泡骨粉10-14h，得到脫脂骨粉；

c.將步驟b制備的脫脂骨粉浸泡在pH 7.4含SDS的10 mM Tris-HCl緩沖液中18-30 h，用PBS緩沖液洗滌；然后在37 ℃下，用pH 7.4含DNase I和RNase A的10 mM Tris-HCl緩沖液繼續浸泡3-6 h，再用PBS緩沖液洗滌并冷凍干燥，得到脫細胞骨粉；

d.將飽和磷酸與磷酸鈣鹽混合，攪拌18-30h，制備pH 2.2~2.8的磷酸-磷酸鹽飽和溶液，過濾；

e.在30℃條件下，向步驟d中制備的磷酸-磷酸鹽飽和溶液中加入步驟c制備的脫細胞骨粉和胃蛋白酶，所述胃蛋白酶的添加量為溶液體積的0.05-0.5%，消化12~36 h；

f.將步驟e獲得液體轉移到透析袋中，0-4℃條件下用去離子水透析4-6 d，向透析后的溶液中加入PBS緩沖液調節溶液鹽濃度到生理條件，加入NaOH溶液調節pH到7.4，得到預凝膠液；

g.使用時，將步驟f的預凝膠液升溫到37±1 ℃，保溫≥10 min，即可得到保留天然羥基磷灰石的脫細胞骨基質水凝膠 。

3.根據權利要求2所述的一種保留天然羥基磷灰石的脫細胞骨基質水凝膠的制備方法，其特征在于：在步驟c和e之間增加如下步驟：將步驟c制備的脫細胞骨粉用pH 7.4 0.1M EDTA溶液浸泡1~4 h，每間隔1 h更換新鮮EDTA溶液后，用PBS緩沖液洗滌并冷凍干燥，得到具有不同羥基磷灰石含量的脫細胞骨粉。

4.根據權利要求2或3所述的一種保留天然羥基磷灰石的脫細胞骨基質水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟a中，滅菌處理的方法為將骨粉在75%乙醇浸泡0.5-1.5h。

5.根據權利要求2或3所述的一種保留天然羥基磷灰石的脫細胞骨基質水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟c中，SDS的濃度為0.5~1 % w/v。

6.根據權利要求2或3所述的一種保留天然羥基磷灰石的脫細胞骨基質水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟c中，所述DNase I的濃度為50~100 U/mL；RNase A的濃度為5~10 U/mL。

7.根據權利要求2或3所述的一種保留天然羥基磷灰石的脫細胞骨基質水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟d中，磷酸鈣鹽選用羥基磷灰石、磷酸三鈣和磷酸一氫鈣中的一種或多種。

8.根據權利要求2或3所述的一種保留天然羥基磷灰石的脫細胞骨基質水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟e中，骨粉的添加量為溶液體積的0.5-5 %。

9.根據權利要求2或3所述的一種保留天然羥基磷灰石的脫細胞骨基質水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟f中，透析袋的截留分子量為3500~5000Da 。

10.根據權利要求2或3所述的一種保留天然羥基磷灰石的脫細胞骨基質水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟f中，NaOH溶液的濃度為0.01~1 M。