[發明專利]一組墨地龍冬瓜InDel分子標記引物及其應用

有效

• 申請號: 202010759852.4
• 申請日: 2020-07-31
• 公開（公告）號: CN111793713B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 弭寶彬;周火強;謝玲玲;武芳芳;肖偉
• 申請（專利權）人: 湖南省蔬菜研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 長沙七源專利代理事務所(普通合伙) 43214
• 代理人: 劉伊旸;周曉艷

本發明公開了一組墨地龍冬瓜InDel分子標記引物及其應用，該組引物包括7個點位所對應的引物對，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.14所示；在對墨地龍冬瓜進行雜交種純度鑒定時，首先提取待檢測樣品種子的基因組DNA作為模板，然后利用上述引物進行PCR擴增，最后通過電泳對擴增產物進行檢測，通過對父母本與雜交種的帶型進行比對，得到真雜交種數與可觀測到條帶的種子總數的比例，即雜交純度。本發明提供的InDel標記可實現對親本及雜交種的有效區別，鑒定成本低、效率高，且鑒定結果與田間鑒定結果的吻合度達99％以上。

技術領域

本發明涉及分子標記技術領域，特別地，涉及一組墨地龍冬瓜InDel分子標記引物及其應用。

背景技術

分子標記是繼形態標記、細胞標記和生化標記之后發展起來的新遺傳標記形式，它以蛋白質、核酸分子的突變為基礎，檢測生物遺傳結構與其變異，可以彌補和克服在形態學鑒定及同工酶、蛋白電泳鑒定中的許多缺陷和難題，因此被廣泛應用于遺傳育種、基因定位和多樣性分析中。在植物遺傳研究中常用的分子標記方法包括限制性片段長度多態性(RFLP)、隨機擴增多態性(RAPD)和簡單重復序列標記(SSR)等，但上述技術存在如下缺陷：RFLP需要放射性同位素的參與，技術較復雜；RAPD實驗重復性較差，結果可靠性較低；SSR相比前兩者較為簡單、便宜，重復性較好，但有些擴增條帶不清楚及出現假等位基因、無效等位基因等技術缺陷，導致SSR標記在基因型分型和數據分析上容易產生錯誤。近年來，隨著基因組測序技術的快速發展，出現了包括InDel和SNP在內的第三代新型分子標記類型，其具有經濟實用、特異性高、穩定性好等特點。

InDel標記指的是在近緣種或同一物種的不同個體間同源序列的等位基因位點上插入或缺失一定的核苷酸片段的分子標記。InDel在基因組中分布廣泛、密度大、數目眾多。就分布密度而言，InDel僅次于SNP，但遠高于SSR，而SNP受限于基因型分型技術，在小型和中型檢測中需要特殊的設備，成本高且操作復雜。因此，InDel標記的應用前景廣闊。

目前，我國對于冬瓜商品種的雜交純度鑒定基本采用田間鑒定法，即根據作物在形態學上的表現來判斷種子是否為雜交，該方法檢測周期長、費時費工、土地占用面積大，加之可用于鑒定雜交種純度的形態特征數量有限，且多數形態特征還易受環境影響，不能滿足當年生產需要。

事實上，我國關于冬瓜分子標記開發利用方面的研究相對較少，也尚未有涉及冬瓜InDel標記應用的相關報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一組墨地龍冬瓜InDel分子標記引物及其應用，以解決背景技術中提出的問題。

本發明的目的通過以下技術方案實現：

一組墨地龍冬瓜InDel分子標記引物，包括7個點位所對應的引物對，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.14所示。

將上述InDel分子標記引物應用于對墨地龍冬瓜雜交種進行純度鑒定。

鑒定方法為：首先提取墨地龍冬瓜待檢測樣品種子的基因組DNA作為模板，然后利用所述InDel分子標記引物進行PCR擴增，最后通過電泳對擴增產物進行檢測，通過對父母本與雜交種的帶型進行比對，得到真雜交種數與可觀測到條帶的種子總數的比例，即雜交純度。

所述鑒定方法具體包括如下步驟：

1)預處理：對墨地龍冬瓜的雜交種子進行溫湯浸種，浸種完成后用清水沖洗掉種子表面的粘液，然后將種子置于清水中在室溫下保存8～12小時，瀝干水分備用；

2)DNA提取：對步驟1)所得的種子進行催芽生根，待胚根長至1cm以上時選取根尖組織加入堿液并用沸水加熱，然后加入緩沖液進行中和，將提取液冷卻至室溫；

3)PCR擴增：以步驟2)所得的提取液中的DNA為模板，加入至少一對InDel分子標記引物進行PCR擴增，獲得擴增產物；