[發(fā)明專利]一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞高通量磁力分選方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010750323.8
• 申請(qǐng)日: 2020-07-30
• 公開（公告）號(hào): CN111733138B
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱志軍;王學(xué)斌;孫麗瑩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/09
• 分類號(hào): C12N5/09;C12M1/42;C12M1/00;B01L3/00
• 代理公司: 北京汲智翼成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11381
• 代理人: 陳曦;劉娟

本發(fā)明公開了一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞高通量磁力分選方法，包括如下步驟：樣本純化：將全血樣本與磁珠混合孵育，磁珠與全血樣本中的靶標(biāo)細(xì)胞結(jié)合；磁珠孵育后的全血樣本經(jīng)過微流控芯片的純化結(jié)構(gòu)區(qū)去除小于分選臨界半徑的細(xì)胞；細(xì)胞聚焦：將步驟（1）純化后的樣本進(jìn)行細(xì)胞聚焦，將大于分選臨界半徑的細(xì)胞聚焦到芯片中央位置，小于分選臨界半徑的細(xì)胞仍保持原路徑；磁力分選：將步驟（2）經(jīng)過細(xì)胞聚焦后的樣本進(jìn)行磁珠分選，磁珠結(jié)合細(xì)胞在磁力架的吸引下分流至磁珠細(xì)胞收集口進(jìn)行收集，非磁珠結(jié)合細(xì)胞仍保持直線形流入非磁珠細(xì)胞收集口流出進(jìn)行收集。利用本發(fā)明，背景細(xì)胞清除率高、腫瘤細(xì)胞捕獲率高、腫瘤細(xì)胞成活率高且可實(shí)現(xiàn)高通量捕獲。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選方法，具體地說是一種利用循環(huán)腫瘤細(xì)胞高通量磁力分選的微流控芯片進(jìn)行的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選方法。

背景技術(shù)

腫瘤是當(dāng)今社會(huì)危害人類健康的主要疾病，目前治療腫瘤的最有效方法為手術(shù)切除，但即使接受了手術(shù)切除治療，患者仍具有一定概率腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，其預(yù)后不良的原因之一是癌細(xì)胞可以輕易進(jìn)入并通過血液傳播。在手術(shù)切除之前，這些患者的血液中可能已經(jīng)存在該類游離腫瘤細(xì)胞。

1896年，澳大利亞學(xué)者 Ashworth在 1 例因癌癥死亡的患者外周血中發(fā)現(xiàn)了類似腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞，并由此提出了循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcell，簡(jiǎn)稱為CTC)的概念。CTC是指從原發(fā)性腫瘤脫離，并進(jìn)入患者淋巴系統(tǒng)、血液循環(huán)的部分癌細(xì)胞。這部分細(xì)胞在患者接受手術(shù)前有可能已經(jīng)存在于血液循環(huán)中，手術(shù)操作有可能促使更多的CTC進(jìn)入血液循環(huán)從而加速腫瘤轉(zhuǎn)移。隨著近年研究的深入，CTC 的應(yīng)用逐漸成為抗癌治療的熱點(diǎn)，被人們稱為“液體活檢”，眾多研究發(fā)現(xiàn)，CTC 不僅可作為早期診斷腫瘤的新型標(biāo)志物，亦可以作為術(shù)后檢測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的靈敏指標(biāo)之一，通過提取研究患者血液中的CTC，有望為患者提供個(gè)性的治療方案，并徹底阻斷腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)途徑，同時(shí)也是實(shí)現(xiàn)CTC體外培養(yǎng)和藥敏實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。CTC的捕獲具有一定難度，主要難點(diǎn)在于該細(xì)胞性質(zhì)的特殊，CTC的含量極低，細(xì)胞本身活性差，難以高效提取并保持足夠活性于下一階段實(shí)驗(yàn)。

目前有多種方法來分離患者血液中的CTC，基于原理大致可分為兩大類，即陽性富集法和陰性富集法，陽性富集法一般基于抗原-抗體原理，特異性捕獲目標(biāo)CTC，例如美國CellSearch系統(tǒng)，是少數(shù)由美國FDA批準(zhǔn)的用于CTC提取的系統(tǒng)之一，根據(jù)使用靶向上皮細(xì)胞粘附的抗體分子（EpCAM）來特異性識(shí)別CTC。然而CellSearch系統(tǒng)還存在一些缺陷，例如CellSearch系統(tǒng)無法實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)分選以及智能捕獲EpCAM陽性細(xì)胞，由于CTC在人體內(nèi)時(shí)刻發(fā)生著改變，當(dāng)其發(fā)生上皮-間質(zhì)樣變時(shí)，其表面EpCAM抗原消失，使依據(jù)識(shí)別該抗體的CTC提取系統(tǒng)失效，且該種方法提取的細(xì)胞通常活性較差，極大限制了后期實(shí)驗(yàn)。陰性富集法原理與陽性富集法相反，采取各種手段去除全血中的背景細(xì)胞收集剩余細(xì)胞即為CTC，例如目前廣泛使用的密度梯度離心法進(jìn)行CTC分離，基于血細(xì)胞之間密度的差異，去除全血中紅細(xì)胞，血小板，白細(xì)胞等背景細(xì)胞得到CTC，該類方法具有快速、直接、非抗原依賴性及操作簡(jiǎn)單，可保持提取細(xì)胞活性等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)該方法操作步驟多、提取率及純度均較低，因?yàn)檠簶颖局幸恍w積與CTC近似的背景細(xì)胞例如白細(xì)胞等殘留細(xì)胞無法精準(zhǔn)分離，將會(huì)影響后續(xù)CTC的培養(yǎng)及藥敏實(shí)驗(yàn)等研究，因此存在CTC提取效率低，純度低等缺陷。