[發明專利]一種提高間充質干細胞成骨能力的方法

在審

• 申請號: 202010749546.2
• 申請日: 2020-07-30
• 公開（公告）號: CN111849878A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 高迎鳳;蒲鋒星;程蕊蘋
• 申請（專利權）人: 陜西佰傲干細胞再生醫學有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供一種提高間充質干細胞成骨能力的方法，包括將間充質干細胞接種于含有10%胎牛血清的α?MEM培養基中培養，間充質干細胞融合度為80%～85%時采用0.2%胰酶消化傳代；將上述得到的間充質干細胞接種于含有10%胎牛血清的α?MEM培養基中培養，間充質干細胞密度大于90%時加入成骨誘導液和二甲雙胍水溶液進行誘導，誘導時間為14～21天。將二甲雙胍作用于間充質干細胞，茜素紅染色結果發現二甲雙胍可以顯著提高細胞鈣礦化結節程度，表明二甲雙胍對間充質干細胞成骨分化具有顯著的誘導作用；二甲雙胍可顯著提高間充質干細胞成骨分化相關基因SIRT1、ALP、COL1A1、RUNX2、BGLAP的表達；間充質干細胞成骨分化能力的提高，對于干細胞移植及骨生物學研究有十分重要的意義。

技術領域

本發明屬于生物領域，具體涉及一種提高間充質干細胞成骨能力的方法。

背景技術

骨組織工程是指將分離的自體高濃度成骨細胞、骨髓基質干細胞或軟骨細胞，經體外培養擴增后種植于一種天然或人工合成的、具有良好生物相容性、可被人體逐步降解吸收的細胞支架或稱細胞外基質上，這種生物材料支架可為細胞提供生存的三維空間，有利于細胞獲得足夠的營養物質，進行氣體交換，排除廢料，使細胞在預制形態的三維支架上生長，然后將這種細胞雜化材料植入骨缺損部位，在生物材料逐步降解的同時，種植的骨細胞不斷增殖，從而達到修復骨組織缺損的目的，因此足夠量的成骨細胞在骨組織工程中成為關鍵因素。如何通過誘導獲得足夠量的成骨種子細胞，并在誘導過程中維持種子細胞的表型特征成為骨組織工程研究中的熱點。

間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSC)是干細胞家族的重要成員，來源于發育早期的中胚層，屬于多能干細胞，MSC最初在骨髓中發現，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點而日益受到人們的關注。如間充質干細胞在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復。MSC由于其自我更新、高增值性和中胚層分化潛力，能夠在臨床實際應用中修復受損組織，促進組織功能修復。但是，隨著對間充質干細胞研究的深入，越來越多的未知領域展現出來，等待深入研究。目前，促進間充質干細胞向成骨細胞分化，改善骨再生修復的效果，是相關領域科學研究和臨床應用的重要問題，現有的間充質干細胞分化為成骨細胞的方法效率較低，故探究并發現一種新的成骨分化方法變得尤為重要。

發明內容

本發明的目的在于，針對現有技術存在的問題，提供一種提高間充質干細胞成骨分化能力的方法。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

一種提高間充質干細胞成骨分化能力的方法，包括如下步驟：

（1）將間充質干細胞接種于含有10%胎牛血清的α-MEM培養基中，置于CO₂培養箱中培養，間充質干細胞融合度為80%～85%時采用0.2%胰酶消化傳代；

（2）將步驟（1）得到的間充質干細胞接種于含有10%胎牛血清的α-MEM培養基中，置于CO₂培養箱中培養，間充質干細胞密度大于90%時加入成骨誘導液和二甲雙胍水溶液進行誘導，誘導時間為14～21天，誘導時間太短，影響間充質干細胞成骨分化的誘導效果，誘導時間太長，會導致間充質干細胞的大量死亡。

二甲雙胍是一種對抗2型糖尿病的常用藥物，通過降低肝臟生產葡萄糖，增加外周組織對胰島素的敏感性，從而實現葡萄糖的利用，其臨床藥效已經受到充分肯定。此外，二甲雙胍能促進成骨細胞活性，增加礦物質沉淀，同時抑制破骨細胞活性，防止骨量減少。二甲雙胍可以誘導成骨樣細胞系（UMR106,MC3T3）的生長和分化，同時具有增加細胞外基質礦化的能力。通過采用二甲雙胍提高間充質干細胞成骨分化能力，對于干細胞移植及骨生物學研究有十分重要的意義。