[發明專利]一種用于副溶血弧菌MLST分型溯源的多重PCR引物組及其二代測序建庫方法

有效

• 申請號: 202010748999.3
• 申請日: 2020-07-30
• 公開（公告）號: CN111808978B
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 張子龍;田楨干;張威;周嫻;李深偉;杜鵑
• 申請（專利權）人: 上海國際旅行衛生保健中心（上海海關口岸門診部）
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12Q1/686;C12Q1/6806;C12Q1/6869;C12N15/11;C40B50/06;C12R1/63
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 瞿曉晶

1.一種用于副溶血弧菌MLST分型溯源的多重PCR引物組，包括recA-1基因擴增用引物或recA-2基因擴增用引物中的一種和gyrB基因擴增用引物、dnaE基因擴增用引物、dtdS基因擴增用引物、pyrC基因擴增用引物、tnaA基因擴增用引物和pntA基因擴增用引物，其特征在于，所述gyrB基因擴增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的gyrB-F1、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的gyrB-F2和核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的gyrB-R1；

所述recA-1基因擴增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的recA-F1、核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的recA-F2、核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的recA-R2和核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的recA-R1；

所述recA-2基因擴增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的recA-F1、核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的recA-F3、核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的recA-R3和核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的recA-R1；

所述dnaE基因擴增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的dnaE-F1、核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的dnaE-F2和核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的dnaE-R1；

所述dtdS基因擴增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.13所示的dtdS-F1、核苷酸序列如SEQ ID No.14所示的dtdS-F2和核苷酸序列如SEQ ID No.15所示的dtdS-R1；

所述pyrC基因擴增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的pyrC-F1、核苷酸序列如SEQ ID No.17所示的pyrC-F2和核苷酸序列如SEQ ID No.18所示的pyrC-R1；

所述tnaA基因擴增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.19所示的tnaA-F2和核苷酸序列如SEQ ID No.20所示的tnaA-R2；

所述pntA基因擴增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.21所示的pntA-F1和核苷酸序列如SEQ ID No.22所示的pntA-R1。

2.一種用于副溶血弧菌MLST分型溯源的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述多重PCR引物組。

3.根據權利要求2所述試劑盒，其特征在于，還包括多重PCR擴增反應用試劑。

4.權利要求1所述引物組或權利要求2或3所述試劑盒在非診斷目的的副溶血弧菌MLST分型溯源中的應用。

5.一種副溶血弧菌MLST分型溯源的二代測序建庫方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）提取待檢測副溶血弧菌的DNA；

2）以步驟1）中提取的DNA為模板，用權利要求1所述多重PCR引物組進行多重PCR擴增，得到多重PCR產物；

3）將所述多重PCR產物兩端添加高通量測序接頭，得到高通量測序文庫。

6.根據權利要求5所述方法，其特征在于，步驟2）中所述多重PCR擴增的反應程序為95℃ 2 min；95℃ 15 sec，56℃ 30 sec，72℃ 30 sec，15個循環；72℃ 5 min。