[發明專利]一種外周血單個核細胞的分離及培養方法

在審

• 申請號: 202010748352.0
• 申請日: 2020-07-30
• 公開（公告）號: CN111849890A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 黃寧;鄭永唐;鄭昌博;楊柳萌;羅榮華;韋海容;王婷;李俊潔
• 申請（專利權）人: 昆明醫科大學
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078
• 代理公司: 北京化育知識產權代理有限公司 11833
• 代理人: 涂琪順

1.一種外周血單個核細胞的分離及培養方法，其特征在于：包括以下步驟：

S1.采集外周血：在無菌環境下，對外周血進行提取，向其中加入抗血凝素；

S2.離心分離：向采集到的外周血進行稀釋，然后向其中加入聚蔗糖-泛影葡胺分層液，通過聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度離心法進行外周血單個核細胞進行分離，使血液形成明顯分層；

S3.提取外周血單個核細胞：用一支毛細吸管對分層中的灰白色層進行吸取，將單個核細胞吸入到毛細吸管中，提取外周血單個核細胞；

S4.對外周血單個核細胞進行純化：通過加入平衡鹽溶液進行清洗，通過二次離心將混雜的血小板去除，得到純化的外周血單個核細胞；

S5.制備細胞培養基：通過將基礎細胞培養基干粉、谷氨酰胺、生長因子、維生素、ALK抑制劑、GSK-3抑制劑、胰島素、白蛋白、碳酸氫鈉、人轉鐵蛋白按照一定的比例進行混合，形成培養液。

S6.進行細胞培養：在培養基中重懸外周血單個核細胞，對外周血單個核細胞進行培養；

S7.進行保存：將培養后的細胞進行進行離心收集，向其中加入細胞凍存液，通過在冰箱中進行冷凍一夜，然后放置于液氮中進行長期保存，比那與后期進行取用。

2.根據權利要求1所述的一種外周血單個核細胞的分離及培養方法，其特征在于：所述聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度離心法的離心溫度為15℃～20℃，離心速度為1800r/min～2000r/min,離心時間為20min～25min。

3.根據權利要求1所述的一種外周血單個核細胞的分離及培養方法，其特征在于：所述二次離心的離心溫度為20℃～25℃，離心速度為1200r/min～1500r/min，離心時間8min～12min，離心次數四次。

4.根據權利要求1所述的一種外周血單個核細胞的分離及培養方法，其特征在于：所述冰箱冷凍溫度為-60℃～-80℃，所述平衡鹽溶液為磷酸緩沖鹽溶液、細胞沖洗液中的一種。

5.根據權利要求1所述的一種外周血單個核細胞的分離及培養方法，其特征在于：所述基礎細胞培養基干粉、谷氨酰胺、生長因子、維生素、ALK抑制劑、GSK-3抑制劑、胰島素、白蛋白、人轉鐵蛋白、碳酸氫鈉按照一定的比例進行混合，形成培養液按照濃度配比為基礎細胞培養基干粉15～20g/l、谷氨酰胺0.5～2g/l、胰島素3～5mg/l、生長因子0.1～0.5mg/l、維生素10～20mg/l、ALK抑制劑1～5ug/l、GSK-3抑制劑1～5ug/l、胰島素5～10mg/l、白蛋白1～5g/l、人轉鐵蛋白5～10mg/l、碳酸氫銨5～15g/l。