[發(fā)明專利]一種高靈敏的檢測黏蛋白的光電化學(xué)傳感器的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010747674.3
• 申請(qǐng)日: 2020-07-30
• 公開（公告）號(hào): CN111830109B
• 公開（公告）日: 2022-08-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李正林;楊紅梅;于京華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 濟(jì)南大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N27/416
• 分類號(hào): G01N27/416;G01N27/327
• 代理公司: 濟(jì)南譽(yù)豐專利代理事務(wù)所(普通合伙企業(yè)) 37240
• 代理人: 趙鳳

1.一種高靈敏的檢測黏蛋白的光電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征是包括以下步驟：

（1）在氧化銦錫（ITO）導(dǎo)電電極上沉積一層金（Au）納米粒子：首先將ITO導(dǎo)電電極依次在丙酮、乙醇、二次水中各清洗10 min，將清洗后的電極插入含有1%-5%氯金酸的沉積液中，利用電位溶出分析法，在沉積電位為-0.2 V，沉積時(shí)間為30-60 s，將金納米粒子沉積在ITO導(dǎo)電電極的表面，沉積完成后，用二次水清洗電極表面，并在室溫下自然干燥，獲得ITO/Au電極；

（2）利用原位生長法在步驟（1）中獲得的電極表面生長TiO₂顆粒：將ITO/Au電極插入含有10-15 mL氟鈦酸銨和硼酸混合液的25 mL燒杯中，所述的氟鈦酸銨濃度為75 mM，硼酸的濃度為0.2-0.4 M，在室溫下反應(yīng)6-12 h，反應(yīng)完成后，用二次水洗滌電極表面并在60 oC干燥3 h，獲得ITO/Au/TiO₂電極；

（3）利用水熱法在步驟（2）中獲得ITO/Au/TiO₂電極表面生長ZnIn₂S₄納米花：將ITO/Au/TiO₂電極插入含有10-15 mL硫酸鋅、氯化銦和硫代乙酰胺混合液的25 mL高壓釜中，使ITO/Au/TiO₂電極傾斜地靠在高壓釜內(nèi)壁上，且導(dǎo)電面向下，所述的硫酸鋅、氯化銦和硫代乙酰胺的濃度均為25-100 mM且摩爾比為1:2:4，在90-120 oC加熱1-3 h，待冷卻到室溫后用二次水洗滌電極表面，并在60 oC干燥3 h，獲得ITO/Au/TiO₂/ZnIn₂S₄電極；

（4）合成二氧化錳/牛血清白蛋白（MnO₂/BSA）顆粒：稱取250 mg BSA分散在7 mL二次水中，30-50 mg高錳酸鉀溶于3 mL二次水中，將兩種溶液混合攪拌均勻后轉(zhuǎn)移至三口燒瓶中，水浴加熱至37 oC后保持2 h，反應(yīng)完成后透析24 h，冷凍干燥得到MnO₂/BSA顆粒；

（5）適配體連接的雜交鏈反應(yīng)：將適配體鏈Apt、引發(fā)鏈S1溶解在雜交鏈反應(yīng)緩沖液TM中，獲得的Apt和S1濃度均為5 μM，將發(fā)夾DNA分子H1和發(fā)夾DNA分子H2溶解在TM中，獲得的H1和H2濃度均為20 μM，所述的TM為pH 8.0，濃度為20 mM且含有50 mM MgCl₂的Tris緩沖溶液，然后用PTC-200熱循環(huán)儀將鏈在95 oC加熱10 min，并在30 s 內(nèi)冷卻到4 oC，隨后，取100 μL Apt和S1的混合溶液加入到1 mL的H1和H2混合溶液中，使Apt、S1、H1和H2的最終濃度分別為0.5 μM、0.5 μM、10 μM和10 μM，將獲得的雜交混合物在37 oC下反應(yīng)12 h，獲得適配體連接的多枝雜交鏈；

（6）合成修飾有MnO₂/BSA顆粒的多枝雜交鏈：取500 μL 1 μM的MnO₂/BSA溶液、500 μL步驟（5）中合成的適配體連接的多枝雜交鏈、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）溶于pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，其中EDC和NHS的濃度分別為20 mM和10 mM，所述的PBS包含55 mM 磷酸鹽，150 mM氯化鈉和20 mM乙二胺四乙酸，將上述混合溶液置于黑暗處震蕩一夜后用pH 7.4 PBS離心洗滌，獲得修飾有MnO₂/BSA顆粒的多枝雜交鏈；

（7）光電化學(xué)傳感器的構(gòu)建：滴加20 μL 0.05 mg/mL的殼聚糖醋酸溶液于步驟（3）中獲得的ITO/Au/TiO₂/ZnIn₂S₄電極表面，并在室溫下孵化4 h，所述的醋酸溶液濃度為1%，用pH7.4 PBS洗滌除去多余的殼聚糖后，再將ITO/Au/TiO₂/ZnIn₂S₄電極插入含有2.5%戊二醛的溶液中2 h，用pH 7.4 PBS洗滌后，將20 μL 0.5 μM 的發(fā)夾鏈HP1滴涂到電極表面，并在室溫下孵化1 h，用pH 7.4 PBS洗滌除去未反應(yīng)的HP1后，繼續(xù)滴涂20 μL 1%的牛血清白蛋白用于封堵非特異性結(jié)合位點(diǎn)，用pH 7.4 PBS洗滌后，在工作電極表面滴加20 μL含有30 U核酸外切酶 I的不同濃度的目標(biāo)檢測物溶液，在37 oC條件下孵育1 h，隨后用pH 7.4 PBS洗滌電極表面，完成光電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建；

（8）采用時(shí)間-電流曲線法在由修飾后的ITO/Au/TiO₂/ZnIn₂S₄電極、Ag/AgCl參比電極和鉑對(duì)電極組成的三電極體系中在電壓0.0 V下進(jìn)行光電化學(xué)信號(hào)檢測，所用的檢測溶液為5 mL含有0.01 M H₂O₂的pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液，通過繪制光電信號(hào)強(qiáng)度與黏蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)對(duì)黏蛋白的檢測。