[發明專利]檢測肺炎支原體的組合物、試劑盒、用途及其方法

有效

• 申請號: 202010745486.7
• 申請日: 2020-07-29
• 公開（公告）號: CN111621582B
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 陳曉亮;任小梅;廖石榴;鄧中平;劉佳;戴立忠
• 申請（專利權）人: 圣湘生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/35
• 代理公司: 北京派特恩知識產權代理有限公司 11270
• 代理人: 董超男;張穎玲

本發明涉及分子生物學檢測領域，更具體地，涉及肺炎支原體的檢測。本發明提供了一種用于檢測肺炎支原體的組合物；同時，還提供了包括該組合物的試劑盒，所述組合物的用途，以及用于檢測肺炎支原體的方法。本發明改善了肺炎支原體的核酸靈敏度不高以及陽性檢出率低的問題，從而能夠快速檢測肺炎支原體感染，為臨床醫生提供充分的快速診斷依據，加快對患者實施正確的治療措施。

技術領域

本發明涉及分子生物學檢測領域，具體地，涉及肺炎支原體的檢測。

背景技術

肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP），曾被稱為胸膜炎微生物（pleuropneumoniae-like organism），是一種可以通過無菌濾器、但無法在標準細菌培養基中進行體外培養、屬于介于病毒和細菌之間的柔膜體綱（Mollicutes），無細胞壁型的原核微生物，由于能形成絲狀與分枝形狀，故稱為支原體。

肺炎支原體呈梭形，長1-2μm，寬0.1-0.2μm，MP的基因組僅816kb，含731個開放讀碼框，其中688個開放讀碼框編碼相關蛋白，MP基因組大小僅為大腸桿菌的1/6，是自然界最小的能自主復制的生物體之一。

P1基因（P1 Cytadhesin Gene）位于肺炎支原體基因組的第180858-185741位，包括一個可讀框（ORF），由4884個核苷酸組成，編碼一個由1627個氨基酸組成的P1黏附蛋白，其相對分子質量為17688。P1黏附蛋白及粘附輔助蛋白能夠形成P1-P90-P40、HMW1-HMW3和P30-P65為代表的三種蛋白復合體定位于肺炎支原體的終端結構上，介導宿主粘附作用并致病。P1基因的表達調控是通過P1操縱子來實現的，P1操縱子一共包括三個ORF，即ORF4、ORF5（P1）和ORF6。P1基因和ORF6中包含一些重復序列，為RepMP2/3、RepMP4和RepMP5。它們的長度變化在1.1-1.5kb（RepMP4）、1.81kb（RepMP2/3）和1.9-2.2kb（RepMP5）之間。許多重復序列都是由中間的可變區域和兩邊的恒定區域組成。依照肺炎支原體M129的全基因序列，共有8個RepMP4序列和10個RepMP2/3序列分散在P1基因和ORF6整個基因組，這些重復序列互相相關卻不相同。

肺炎支原體是社區獲得性肺炎的常見病原體，感染MP后可引起非典型性肺炎（Atypical pneumonias），病理改變以間質性肺炎為主，有時并發支氣管肺炎。主要經飛沫傳染，潛伏期2～3周，發病率以青少年最高，大多數患者只有頭痛、咽痛、發熱、咳嗽等一般的呼吸道癥狀；少數會持續高熱不退，劇烈咳嗽，病情進展快，短時間內出現呼吸衰竭，多器官功能性障礙等危重癥變現。肺炎支原體也是兒童社區獲得性肺炎的重要病原之一，不僅是學齡期和學齡前期兒童的常見病原，在1-3歲嬰幼兒中亦不少見。

但是這些臨床癥狀與細菌性肺炎的臨床癥狀一致，往往在確診之前會錯誤地使用抑制細菌細胞壁合成的抗生素，從而導致延誤治療時間。而現行的檢測肺炎支原體的產品均為針對單拷貝序列或者一個多拷貝序列的檢測，未涉及到兩個不同的多拷貝序列，其靈敏度不高，不能夠在感染早期就能快速確診肺炎支原體感染。

因此，現有技術缺乏一種能夠高靈敏度從而快速檢測肺炎支原體感染的產品，從而為臨床醫生提供充分的快速診斷依據，加快對患者實施正確的治療措施。

發明內容

為解決以上問題，本發明人進行了大量分析和實驗研究，發現針對肺炎支原體的基因組中RepMP4基因和RepMP2/3基因的兩個特定區域，來設計qPCR檢測的擴增引物以及探針，能夠有效地提高核酸陽性檢出率，據此完成本發明。

上述所提及的兩個特定區域分別為：