[發明專利]人參PDS基因及其應用

在審

• 申請號: 202010744461.5
• 申請日: 2020-07-29
• 公開（公告）號: CN111826356A
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 張美萍;王義;李俐;姜悅;趙明珠;王康宇;孫春玉;朱蕾
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/82;A01H5/12;A01H6/82;A01H6/00
• 代理公司: 長春市東師專利事務所 22202
• 代理人: 張鐵生;劉瑩

本發明公開了一種人參PDS基因，它的堿基序列如序列表SEQ ID NO.1所示；一種植物超表達載體，它插入了如序列表SEQ ID NO.1所示的基因；所述的人參PDS基因在促進植物葉片葉綠素的合成方面的應用；本發明結果證實了PgPDS基因的基因沉默序列，可以導致人參幼苗和果實出現白化；在超表達PgPDS基因的煙草葉片中，葉綠素含量顯著上升；說明人參PDS基因的超表達可以促進葉片葉綠素的合成。

技術領域

本發明屬于生物基因工程技術領域，具體涉及人參PDS基因及其應用。

背景技術

人參是五加科、人參屬、多年生草本植物，是一種馳名中外的名貴藥材，主產于我國吉林、遼寧、黑龍江等省及韓國、俄羅斯等地。人參中含有豐富的藥用成分，包括皂苷、有機酸、甾醇、多肽、黃酮等，其中人參皂苷是人參的主要藥用活性成分。人參對人體具有抗癌、提高免疫力、促進血液循環、調節內分泌、抗衰老等作用，目前已被廣泛應用到醫療保健、美容、食品等行業。

為了研究人參皂苷的合成、轉運及調控等過程，研究者利用多種方法對人參中的重要功能基因進行了分析、克隆、功能驗證及作用機制研究。目前對人參功能基因的研究與驗證技術包括實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR）、RNA干擾（RNA interference, RNAi）、同源與異源超量表達等。但人參生殖周期長、生長條件嚴格等特點阻礙了人參的相關研究的進程。雖然人參愈傷組織、不定根、發狀根等培養體系及在此基礎上的人參遺傳轉化方法的建立，為人參重要功能基因的研究與驗證提供了基礎，但依然存在實驗周期長、操作繁瑣等缺點，因此在人參中建立操作簡單、實驗周期短的基因功能驗證方法十分必要。

病毒誘導的基因沉默（Virus induced gene silencing，VIGS）是根據植物體對入侵病毒抵御機制所研發的研究基因功能的新技術。VIGS基因沉默技術屬于轉錄后水平調控，常用載體包括RNA病毒載體、DNA病毒載體和衛星病毒載體三種。目前最為常用的是RNA病毒載體，如煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）、煙草脆裂病毒（Tobaccorattle virus, TRV）等。其中，煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus, TRV）基因沉默載體具有分子質量較小、外源序列插入方便、侵染效率高、病毒感染癥狀輕、沉默效率高等優點，在擬南芥、番茄等植物中已被廣泛應用。

RNA病毒載體介導的基因沉默機制為：攜帶目的基因的重組病毒載體進入植物細胞核后，RNA病毒載體在RNA聚合酶（RdRp）作用下形成大量的轉錄產物dsRNA；這些新合成的dsRNA在酶作用下切割形成21-25個核苷酸的小干擾RNA （siRNA）；siRNA的反義鏈通過與RNA誘導的沉默復合體RISC相結合而被激活；帶有siRNA的RISC特異地結合與siRNA高度同源的RNA序列，繼而以目的基因的mRNA為模板、siRNA為引物、在RNA聚合酶的作用下合成dsRNA，呈現出級聯放大效應，從而導致了該目的基因的mRNA無法行使信使功能。VIGS基因沉默技術不但操作簡便，并且能夠通過鑒別當代植株特定基因功能缺失的表現型直接關注所研究的基因，從而大幅度縮短驗證基因功能所需時間，特別是對于遺傳轉化操作困難或生長周期長的植物，在其基因功能研究中具有非常大的優勢。

八氫番茄紅素脫氫酶 (phytoene desaturase)位于類胡蘿卜素生物合成途徑的上游,是該代謝途徑中的關鍵限速酶之一,影響整個代謝途徑的合成速度和產物水平。該酶由PDS基因編碼，該基因目前已在多種藻類、高等植物中被克隆鑒定。研究表明,該基因在植物體內以單拷貝形式存在, 其編碼的蛋白定位于葉綠體的類囊體上，主要在植物的葉片、花朵和果實中表達。當該基因表達受阻時，植物會出現光漂白現象,表型肉眼易觀測，因此在植物VIGS基因沉默體系中一般將PDS基因作為報告基因來反映沉默效率。

發明內容