[發明專利]3-氯鄰苯二酚降解基因簇的優化重組與應用

有效

• 申請號: 202010741963.2
• 申請日: 2020-07-29
• 公開（公告）號: CN111808871B
• 公開（公告）日: 2023-01-13
• 發明（設計）人: 王波;姚泉洪;彭日荷;田永生;高建杰;許晶;付曉燕;韓紅娟;李振軍;王麗娟;張福建;鄧永東;張文慧;黃悠楠
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/55;C12N15/61;C12N9/02;C12N9/90;C12N9/18;C12N15/70;C12N1/21;C02F3/34;C12R1/19;C02F101/36;C02F101/34
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 周新楣

本發明公開了一種優化后適用于大腸桿菌表達的3?氯鄰苯二酚降解基因簇及其應用。該基因簇包含四個相關基因，每個基因都由獨立的T7啟動子和終止子控制，其核苷酸序列分別如SEQ ID No 1、SEQ ID No 2、SEQ ID No 3和SEQ ID No 4所示，其編碼的蛋白質的氨基酸序列分別如SEQ ID No 5、SEQ ID No 6、SEQ ID No 7和SEQ ID No 8所示。本發明優化合成的基因能夠在大腸桿菌中成功表達，發現陽性株系不僅能夠降解3?氯鄰苯二酚，還可以降解鄰苯二酚和4?氯鄰苯二酚，因此本發明所優化的基因簇可用于制備降解3?氯鄰苯二酚、鄰苯二酚和4?氯鄰苯二酚的微生物。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及結構優化的、包含3-氯鄰苯二酚降解相關四個基因的基因簇序列。

背景技術

隨著社會的不斷進步和工農業的飛速發展，有機污染物在土壤中的含量急劇上升，它們大多具有“致癌、致畸、致突變”作用，嚴重危及到了人類的生存環境。上海地區隨著產業結構的升級，工業企業搬遷后騰出的土地是有機污染的重點區域，同時，固體廢物的堆放傾倒、有害廢水向土壤中的滲透及污水灌溉也是造成土壤有機污染的重要來源。因此，如何有效清除環境中存在的有機污染物已經成為急需解決的問題。

氯代芳香族化合物廣泛應用于生產和生活的方方面面。酚類化合物是煤、石油等化工業排放的一類重要污染物，特別是氯代酚類常做為防腐劑、防銹劑、殺菌劑等應用。氯代苯類化合物在農藥、制藥、染料、溶劑等生產中廣泛存在，它們能夠通過食物鏈進入人體，對人的肝臟、腎臟和神經系統造成損害。微生物是生態循環中的分解者，并且具有極強的適應性，其中很多能夠降解氯代芳香族化合物并以這些物質為碳源和能源生長。通過研究發現，許多氯代芳香族化合物的降解都能夠先通過不同的代謝途徑轉化為3-氯鄰苯二酚或4-氯鄰苯二酚，再經過相同或相似的途徑打開苯環，最終為微生物所利用。例如，有研究發現，一種紅球菌（Rhodococcus opacus 1CP）對2-氯苯酚的降解就是通過先將其轉化為3-氯鄰苯二酚后再通過開環并最終利用的（Journal of Bacteriology, 184 (2002): 5282-5292）。

生物修復是一種極具潛力污染修復方式，但目前可供利用的微生物還十分有限，且難以適應不同環境條件下的應用需求。因此，如果我們能夠通過生物技術手段，有目的的賦予目標生物污染物降解的能力，將極大的拓展可供利用的生物范圍、促進生物修復的廣泛應用，為生態環境的保護與修復提供技術支持。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供能夠在大腸桿菌中表達的3-氯鄰苯二酚降解相關四個基因：clcA: 氯代鄰苯二酚1,2雙加氧酶、clcB: 氯代氯粘康酸環異構酶、clcD:編碼二烯內酯水解酶、clcE: 編碼二烯內酯水解酶，3-氯鄰苯二酚經過連續四步酶促反應生成β-酮己二酸。

基于Pseudomonas putida菌原始轉座子（AJ617740.2），該轉座子全長105032bp，其中包含多個結構基因和大量未知功能的開放閱讀框。本發明所涉及的四個基因成簇存在，該段序列還包含了一個轉錄調節因子基因和一個未知功能的開放閱讀框。本發明針對四個結構基因：clcA、clcB、clcD、clcE進行基因結構優化與重組，并分別為每個基因連接上獨立的T7啟動子和終止子調控其表達。對編碼區基因結構的優化遵循以下原則：（一）優化基因密碼子，提高基因翻譯效率。（二）消除基因內部的常用限制性內切酶的識別位點，便于表達盒構建。（三）消除逆向重復序列、莖環結構和轉錄終止信號，使基因內部的GC/AT均衡，提高RNA的穩定性。（四）使基因編碼蛋白符合N端原則，以提高翻譯蛋白的穩定性。（五）優化mRNA二級結構自由能，以提高基因表達效率。