[發(fā)明專利]一種真菌來源的漆酶g2589及其基因和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010740712.2
• 申請日: 2020-07-29
• 公開（公告）號: CN111690622B
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅會穎;張亨;姚斌;王亞茹;黃火清;柏映國;蘇小運(yùn);王苑;涂濤;張杰
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/81;C12N15/53;C12N1/19;A23K20/189;A23L29/00;C12R1/84
• 代理公司: 北京法信智言知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11737
• 代理人: 劉靜榮

本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種真菌來源的漆酶g2589及其基因和應(yīng)用。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。該漆酶具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：酸性、較高的反應(yīng)溫度、較好的溫度穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性。所有這些優(yōu)點(diǎn)都意味著該漆酶可用于飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種真菌來源的漆酶g2589及其基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)

漆酶(laccase,p-diphenol:dioxygen oxidoreductases,EC 1.10.3.2)是一類含銅的多酚氧化酶，屬于木質(zhì)素分解酶系。漆酶具有廣泛的底物譜，能夠催化2,6-二甲氧基苯酚（DMP），丁香醛（SGZ），愈創(chuàng)木酚等芳香族化合物；催化2,2-疊氮基-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯（ABTS）、1-羥基苯并三唑（HOBT）、N-羥基鄰苯二甲酰亞胺（NHPI）等非酚性底物；更能再介體存在的情況下氧化更加復(fù)雜的底物。因其底物的廣譜性及綠色的催化特性，在環(huán)保、造紙、紡織、食品等領(lǐng)域具有非常高的應(yīng)用價(jià)值。

真菌漆酶的反應(yīng)條件一般在溫和條件下進(jìn)行，其反應(yīng)的最適溫度范圍較窄，通常在25-50℃之間。最適反應(yīng)pH通常為3.5-6.0，如云芝栓孔菌所產(chǎn)漆酶的最適pH為3.8,多孔菌為4.2。在漆酶的生產(chǎn)過程中，不僅要保證漆酶的高活性，還要考慮漆酶的穩(wěn)定性，多數(shù)真菌漆酶pH穩(wěn)定性并不理想，如白腐真菌糙皮側(cè)耳所產(chǎn)漆酶在pH為3.0的高酸性環(huán)境下活性較強(qiáng),但漆酶穩(wěn)定性較差；而pH呈中性至堿性時(shí)，漆酶穩(wěn)定性較強(qiáng)但活性非常低。另外，關(guān)于耐高溫特性的真菌漆酶報(bào)道較少，目前高溫漆酶大多數(shù)為細(xì)菌漆酶。漆酶的生產(chǎn)是工業(yè)化應(yīng)用的基礎(chǔ)，發(fā)掘性質(zhì)優(yōu)良的漆酶并提高其活性，將是今后不斷研究的重點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種漆酶。

本發(fā)明的再一目的是提供上述漆酶的基因。

本發(fā)明的再一目的是提供包含上述漆酶的重組載體。

本發(fā)明的再一目的是提供包含上述漆酶基因的重組菌株。

本發(fā)明的再一目的是提供一種制備漆酶的方法。

本發(fā)明的再一目的是提供上述漆酶的應(yīng)用。

本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的、適合于在食品、飼料、醫(yī)藥等行業(yè)中應(yīng)用的新的漆酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1：

其中，該酶全長603個(gè)氨基酸，N端22個(gè)氨基酸為信號肽序列（ SEQ ID NO.2）。

因此，成熟的漆酶g2589的理論分子量為64 kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3：

該漆酶的最適pH為4.5，在pH 4.0-pH 4.5范圍內(nèi)，該酶能夠維持其70%以上的酶活力；最適溫度70℃，在75℃時(shí)具有30%以上的酶活力。

本發(fā)明還提供了編碼上述漆酶的基因。DNA全序列分析結(jié)果表明，漆酶g2589結(jié)構(gòu)基因全長為1812bp，含有2個(gè)內(nèi)含子，本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了這個(gè)漆酶基因g2589，漆酶g2589的cDNA全長為1809bp，其序列如SEQ ID NO.4所示。

其中，信號肽的堿基序列如SEQ ID NO.5所示。

因此，成熟漆酶的編碼序列如SEQ ID NO.6所示。

該漆酶的理論分子量為64 kDa，通過BLAST發(fā)現(xiàn)該酶屬于漆酶。該漆酶在氨基酸水平上與Aspergillus sclerotioniger CBS 115572來源的漆酶TILA最為相近，相似度僅為69%，確定g2589是一種新的漆酶。