[發(fā)明專利]一種評(píng)估溫和式殺孢方法效果的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010739425.X
• 申請(qǐng)日: 2020-07-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111999237B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 顏曉梅;趙凡毓;林垚;何盛斌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廈門(mén)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N15/14
• 分類號(hào): G01N15/14
• 代理公司: 北京英創(chuàng)嘉友知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11447
• 代理人: 耿超

本公開(kāi)涉及一種評(píng)估溫和式殺孢方法效果的方法，包括：使用萌發(fā)劑對(duì)芽孢污染物萌發(fā)處理；使用待評(píng)估的溫和式殺孢方法對(duì)萌發(fā)后的芽孢污染物進(jìn)行殺菌處理，得到滅菌后的芽孢污染物；收集滅菌后的芽孢污染物中的芽孢并懸浮于第一懸浮介質(zhì)中，得到第一懸浮液；將第一懸浮液進(jìn)行離心處理，收集沉淀物懸浮于第二懸浮介質(zhì)中，得到第二懸浮液；使用活細(xì)胞染料進(jìn)行第一熒光標(biāo)記，得到第一標(biāo)記待測(cè)產(chǎn)物；使用核酸探針進(jìn)行第二熒光標(biāo)記，得到第三懸浮液；使用高靈敏度流式細(xì)胞儀對(duì)第三懸浮液中顆粒的熒光進(jìn)行檢測(cè)。本公開(kāi)的方法可以縮短評(píng)估溫和式殺孢方法效果的時(shí)間，還可以為殺孢劑的研制與優(yōu)化提供有力的技術(shù)支持。

技術(shù)領(lǐng)域

本公開(kāi)涉及殺菌技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種評(píng)估溫和式殺孢方法效果的方法。

背景技術(shù)

芽孢是一些細(xì)菌在極端環(huán)境如營(yíng)養(yǎng)條件缺乏時(shí)形成的一種圓形或橢圓形的休眠體。跟普通營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞相比，芽孢具有耐高溫、耐輻射、耐干燥和耐多種有毒化學(xué)物質(zhì)等抗逆性特點(diǎn)。細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在70-80℃的條件下維持10分鐘就死亡了，而芽孢在120-140℃的條件下還能存活幾個(gè)小時(shí)；營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在5％苯酚溶液中很快就會(huì)死亡，而芽孢卻能存活15天。而且一些物種的芽孢是人類疾病的載體，如產(chǎn)氣莢膜梭菌會(huì)引起氣性壞疽、食物中毒和肌肉壞死；艱難梭菌會(huì)引起嚴(yán)重且常常致命的腹瀉；炭疽芽孢桿菌芽孢是一種潛在的生物武器和生物恐怖主義的主要媒介，給人類的安全造成了嚴(yán)重的威脅。很多需氧性芽孢桿菌和厭氧性梭狀芽孢桿菌是造成食物變質(zhì)的元兇，威脅著商品的貨架期及品質(zhì)，給很多食品以及發(fā)酵工業(yè)都造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，如何徹底殺滅細(xì)菌芽孢成為制藥、食品、生物防御工業(yè)和醫(yī)療環(huán)境衛(wèi)生面臨的巨大挑戰(zhàn)。

現(xiàn)在使用的殺滅細(xì)菌芽孢的技術(shù)多為高溫滅菌以及高濃度化學(xué)制劑長(zhǎng)期浸泡等方法。這些方法會(huì)使食品的色澤、風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分等發(fā)生變化，也會(huì)對(duì)被消毒物品的品質(zhì)造成一定的損害，甚至?xí)o環(huán)境帶來(lái)嚴(yán)重的污染。因此，使用一種更加溫和的殺孢方法就變得十分重要。目前使用的溫和式殺孢方法是依據(jù)萌發(fā)后的芽孢抗逆性消失，用比較溫和的方法就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)芽孢的殺滅這一原理提出的。但如何準(zhǔn)確快速的評(píng)估這類溫和式殺孢方法的殺孢效果成為目前亟待解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本公開(kāi)的目的在于提供一種評(píng)估不同溫和式殺孢方法效果的方法，該方法能夠區(qū)分芽孢的幾種不同形態(tài)，包括未萌發(fā)的芽孢、萌發(fā)后被殺死的芽孢和萌發(fā)后活的芽孢。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本公開(kāi)提供了一種評(píng)估溫和式殺孢方法效果的方法，該方法的步驟包括：

S1、使用萌發(fā)劑對(duì)芽孢污染物萌發(fā)處理，得到萌發(fā)芽孢污染物；

S2、使用待評(píng)估的溫和式殺孢方法對(duì)所述萌發(fā)芽孢污染物進(jìn)行殺菌處理，得到滅菌后的芽孢污染物；

S3、收集所述滅菌后的芽孢污染物中的芽孢并懸浮于第一懸浮介質(zhì)中，得到第一懸浮液；將所述第一懸浮液進(jìn)行離心處理，收集沉淀物；將所述沉淀物懸浮于第二懸浮介質(zhì)中，得到第二懸浮液；

S4、使用活細(xì)胞染料對(duì)所述第二懸浮液進(jìn)行第一熒光標(biāo)記，得到第一標(biāo)記待測(cè)產(chǎn)物；使用核酸探針對(duì)所述第一標(biāo)記待測(cè)產(chǎn)物進(jìn)行第二熒光標(biāo)記，得到第三懸浮液；

S5、使用高靈敏度流式細(xì)胞儀對(duì)所述第三懸浮液中顆粒的熒光進(jìn)行檢測(cè)。

可選地，步驟S5中，使用高靈敏度流式細(xì)胞儀對(duì)所述第三懸浮液中顆粒的400-800nm的散射光和熒光進(jìn)行檢測(cè)；根據(jù)所述第三懸浮液中顆粒的第一熒光信號(hào)所轉(zhuǎn)換得到的電信號(hào)區(qū)分萌發(fā)后活的芽孢和其他狀態(tài)的芽孢，所述其它狀態(tài)的芽孢包括未萌發(fā)的芽孢和萌發(fā)后被殺死的芽孢；根據(jù)所述第三懸浮液中顆粒的第二熒光信號(hào)所轉(zhuǎn)換得到的電信號(hào)區(qū)分芽孢的萌發(fā)狀態(tài)。

可選地，以所述芽孢污染物的重量為基準(zhǔn)，所述萌發(fā)劑的含量為5-100mM，優(yōu)選為10-40mM。