[發(fā)明專利]62個多等位SNP-NGS的分型遺傳標記組合物、試劑盒、鑒定體系以及分型方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010738437.0 | 申請日： | 2020-07-28 |
| 公開（公告）號： | CN111793623A | 公開（公告）日： | 2020-10-20 |
| 發(fā)明（設計）人： | 李淑瑾;叢斌;布蕾楠;付麗紅;王茜;付光平;盧朝龍 | 申請（專利權(quán)）人： | 河北醫(yī)科大學 |
| 主分類號： | C12N15/11 | 分類號： | C12N15/11;C12Q1/6876;C12Q1/6858 |
| 代理公司： | 河北國維致遠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 13137 | 代理人： | 墨偉 |
| 地址： | 050017 河*** | 國省代碼： | 河北;13 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 62 等位 snp ngs 遺傳 標記 組合 試劑盒 鑒定 體系 以及 方法 | ||
1.一種遺傳標記組合物，其特征在于：包括62個多等位SNPs以及至少兩個Y-SNPs，所述62個多等位SNPs在SNP數(shù)據(jù)庫中的rs號分別為：rs2490541、rs4656384、rs6665748、rs11687477、rs2705772、rs2187012、rs4973360、rs404753、rs4683078、rs9879721、rs4525830、rs62409414、rs1377902、rs10014519、rs12520142、rs12187324、rs1974790、rs1549226、rs9368129、rs752761、rs12669779、rs11975827、rs9691758、rs4872939、rs2122705、rs2634525、rs2035637、rs2002299、rs6478720、rs3006953、rs76149384、rs10837608、rs4938084、rs3107631、rs11045217、rs2172244、rs709237、rs8001988、rs9558636、rs7317569、rs4322570、rs1074004、rs34751254、rs10131888、rs4904514、rs4779204、rs8028205、rs8032485、rs7179436、rs1010351、rs12596775、rs9797242、rs12940150、rs2931275、rs72863906、rs9304194、rs1303783、rs10406637、rs2143705、rs6062145、rs1850106、rs7280955。
2.一種下一代測序分型試劑盒，其特征在于：包括用于擴增權(quán)利要求1所述62個多等位SNPs以及至少兩個Y-SNPs的引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的下一代測序分型試劑盒，其特征在于：擴增權(quán)利要求1所述62個多等位SNPs的所述引物為63條PCR擴增單端特異性引物以及與所述63條PCR擴增單端特異性引物構(gòu)成常規(guī)PCR的正反向引物，所述63條PCR擴增單端特異性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.63所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的下一代測序分型試劑盒，其特征在于：所述下一代測序分型試劑盒還包括MiSeq上機測序試劑；和/或所述下一代測序分型試劑盒還包括10×酶切反應緩沖液、FERA緩沖液、酶切反應中酶混合物、5×連接反應緩沖液、連接接頭、DNA連接物、連接溶液、5×靶向PCR反應緩沖液、與所述63條PCR擴增單端特異性引物構(gòu)成常規(guī)PCR的正反向引物、與擴增所述Y-SNPs的引物構(gòu)成常規(guī)PCR的正反向引物、Taq DNA聚合酶和5×常規(guī)PCR反應緩沖液。
5.一種用于個體識別的鑒定體系，其特征在于：包括權(quán)利要求3所述的下一代測序分型試劑盒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鑒定體系，其特征在于：還包括血液DNA提取試劑盒、QubitdsDNA HS定量試劑盒、Labchip質(zhì)檢分析試劑盒和KAPA文庫定量試劑盒。
7.一種下一代測序分型方法，其特征在于：用權(quán)利要求5或6所述的鑒定體系進行樣品檢測。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的下一代測序分型方法，其特征在于：所述方法至少包括以下操作步驟：
步驟a、提取待測血液的DNA，定量，采用上述試劑盒中的63條PCR擴增單端特異性引物以及擴增所述Y-SNPs的引物構(gòu)建文庫，定量；
步驟b、對所述文庫進行片段檢測，定量；
步驟c、根據(jù)步驟b的定量結(jié)果，對文庫中的樣本進行均一化，然后變性、稀釋，測序；
步驟d、將測序結(jié)果與hg19參考基因進行序列對比，得到分型結(jié)果。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的下一代測序分型方法，其特征在于：步驟a中構(gòu)建文庫的操作包括DNA片段化、末端加A、連接接頭、清洗、靶向富集、清洗富集產(chǎn)物、常規(guī)PCR擴增、清洗擴增產(chǎn)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的下一代測序分型方法，其特征在于：所述靶向富集的PCR反應循環(huán)參數(shù)為：95℃，13min；98℃，2min；98℃，15s，68℃，10min，8次循環(huán)；72℃，5min；4℃，5min；和/或
步驟c中，測序的操作在Illumina MiSeq FGx平臺進行；和/或
步驟c中變性使用的試劑為0.2N-NaOH。
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