[發(fā)明專利]一種特異性抗噻蟲啉抗體的可變區(qū)序列及其重組完整抗體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010736700.2
• 申請日: 2020-07-28
• 公開（公告）號: CN112111010B
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郭逸蓉;劉鵬琰;趙穎;郭源昊;焦沙沙;柳穎;朱國念
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C12N15/13;C12N15/70
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 金杭

本發(fā)明公開了一種特異性抗噻蟲啉抗體的可變區(qū)序列，重鏈可變區(qū)編碼基因的氨基酸序列為SEQ ID NO:2所示。本發(fā)明還公開了一種抗噻蟲啉重組完整抗體，包括重鏈恒定區(qū)、重鏈可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)編碼基因的氨基酸序列為如SEQ ID NO:2所示。本發(fā)明又公開了一種抗體表達質(zhì)粒。將本發(fā)明得到的序列基因分別連接到包含了重鏈恒定區(qū)基因和輕鏈恒定區(qū)基因的表達載體，采用雙質(zhì)粒系統(tǒng)的哺乳動物細胞表達獲得了重組完整抗體，保證了鼠源親本抗體的識別活性，并使得抗噻蟲啉抗體可大批量穩(wěn)定生產(chǎn)，為噻蟲啉殘留檢測的各種免疫分析方法提供了可靠的核心試劑。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種特異性抗噻蟲啉抗體的可變區(qū)序列及其重組完整抗體的制備。

背景技術(shù)

噻蟲啉(3-(6-氯-3-甲基吡啶)-1，3-噻唑烷-2-亞氰胺)是一種具有噻唑環(huán)的新型氯代煙堿類殺蟲劑，因其結(jié)構(gòu)獨特，性能與傳統(tǒng)煙堿類殺蟲劑相比更為優(yōu)異，而被廣泛應(yīng)用于防治刺吸式口器和咀嚼式口器害蟲對農(nóng)作物的危害。噻蟲啉有較強的內(nèi)吸和滲透作用，因此會分布在作物各個部位，且因其具有水溶性強和半衰期長等特點，很容易通過降雨和灌溉等途徑進入到地表水和土壤中。研究表明，地表水、沉積物和土壤中存在著較高水平的噻蟲啉殘留，這些農(nóng)藥殘留對蜜蜂等傳粉動物、水生和土壤無脊椎動物造成了巨大威脅。還有研究認為，噻蟲啉對人類具有潛在致癌性及可能的生殖毒性與內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，因此2020年歐盟開始實施對噻蟲啉的禁用令。為防止消費者和有益生物受到噻蟲啉殘留的危害，對環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中噻蟲啉殘留的及時監(jiān)測具有重要的意義。

目前，針對噻蟲啉殘留的檢測方法主要有基于儀器的檢測方法和基于免疫分析的檢測方法。儀器分析方法有HPLC、GC和MS等，這些儀器分析方法均具有很高精密度、準確度和靈敏度，能夠滿足噻蟲啉的精準定性定量的檢測要求，但儀器分析方法需要昂貴的分析儀器、專業(yè)的實驗人員和復雜的樣品前處理程序，因此很難實現(xiàn)大規(guī)模的現(xiàn)場快速分析，而免疫分析快速檢測方法能滿足農(nóng)藥殘留現(xiàn)場檢測以及大批量樣本篩查的需求。

目前，已有抗噻蟲啉單抗及其免疫快速檢測方法的少量公開報道，例如Yin等人報道的基于噻蟲啉抗體和抗原模擬表位多肽建立的ELISA方法對噻蟲啉的檢測靈敏度(IC₅₀)和最低檢測限(IC₁₀)分別是26.3和1.4μg/L(Yin,W.；Hua,X.；Liu,X.；Shi,H.；Gee,S.J.；Wang,M.；Hammock,B.D.,Anal.Biochem.,2015,481,27–32.)。Ding等人報道的基于傳統(tǒng)單抗建立的ELISA方法對噻蟲啉的IC₅₀和IC₁₀分是2.31ng/mL和0.44ng/mL(Ding,Y.；Chen,H.；Yang,Q.；Feng,L.；Hua,X.；Wang,M.,RSC Adv.,2019,9,36825–36830.)。

農(nóng)藥免疫分析快速檢測技術(shù)是基于農(nóng)藥抗原和抗體的特異性結(jié)合而實現(xiàn)的，故抗體的制備是農(nóng)藥免疫快速檢測的核心關(guān)鍵。傳統(tǒng)的抗體有多克隆抗體和單克隆抗體，均是通過免疫動物而制備的，且后者因只有一個抗原識別表位特異性強而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥免疫分析快速檢測。依賴雜交瘤細胞制備單克隆抗體這一技術(shù)生產(chǎn)成本高、耗時，且需要雜交瘤細胞的長期低溫保存和定期馴化，但在這些過程中雜交瘤細胞會因保存條件不當，有效基因丟失或突變而無法產(chǎn)生有效的抗體。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，序列明確的重組抗體逐漸變成研究熱點，包括單鏈抗體、Fab抗體、重組完整抗體等。在眾多重組抗體表達系統(tǒng)中，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)能夠指導重組抗體的正確折疊，提供準確的多種翻譯后的加工和修飾功能，因此可以穩(wěn)定產(chǎn)生與親本抗體活性一致的重組抗體，不僅證實了親本抗體可變區(qū)序列的準確性，還可以解決常規(guī)抗體制備面臨的許多問題，如傳統(tǒng)抗體的批次間差異、細胞株傳代保存過程中容易丟失有效基因而導致細胞株無法產(chǎn)生有效抗體。只要獲得正確的抗體序列基因，就可以在體外大量制備多種形式的重組抗體(包括全長IgG完整抗體、單鏈抗體scfv、抗原識別片段Fab等)，而無需犧牲小鼠來制備腹水抗體，操作簡便，制備周期短，有利于大規(guī)模產(chǎn)生抗體，并有助于靈敏、可靠的農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。