[發明專利]一種Aspergillus nidulans幾丁質脫乙酰基酶突變體

在審

• 申請號: 202010736310.5
• 申請日: 2020-07-28
• 公開（公告）號: CN111944793A
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發明（設計）人: 劉姝;張春光;杭加豪;房耀維;盧靜;楊杰;侯曉月;陳佳雨;張弘彧
• 申請（專利權）人: 江蘇海洋大學
• 主分類號: C12N9/80
• 分類號: C12N9/80;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 嚴志平

本發明公開了一種Aspergillus nidulans幾丁質脫乙酰基酶突變體，其特征在于：將真菌Aspergillus nidulans幾丁質脫乙酰基酶氨基酸序列進行了如下突變：139位亮氨酸（L）突變為甘氨酸（G），164位賴氨酸（K）突變為谷氨酸（E），166位酪氨酸（Y）突變為色氨酸（W），171位丙氨酸（A）突變為色氨酸（W），195位丙氨酸（A）突變為谷氨酸（E），199位組氨酸（H）突變為天冬酰胺（D），所述真菌Aspergillus nidulans幾丁質脫乙酰基酶氨基酸序列GenBank收錄號為XM_677557.1；本發明通過定點突變改造幾丁質脫乙酰基酶基因，使所編碼的幾丁質脫乙酰基酶催化活性增加，是比活力是野生型酶的2.95倍，大大提高了幾丁質脫乙酰基酶的催化效率，同時適用于工業生產需求，值得推廣。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，公開了海洋細菌A.nidulans幾丁質脫乙酰基酶的突變體，尤其涉及一種Aspergillus nidulans幾丁質脫乙酰基酶突變體。

背景技術

幾丁質又稱甲殼素或甲殼質，廣泛存在于蝦蟹等甲殼類動物的外骨骼以及藻類和真菌的細胞壁中，是常見的天然有機化合物，由N-乙酰-D-葡萄糖胺通過β-1, 4糖苷鍵連接而成，難溶于水和有機溶劑，其開發應用受到限制，但是幾丁質脫去55%以上乙酰基獲取的產物為殼聚糖（Chitosan），殼聚糖又稱為脫乙酰甲殼素、甲殼胺或可溶性幾丁質，是由幾丁質經一定程度的脫乙酰過程而生產出來的衍生物，其易溶于水，可進行多種化學修飾，廣泛應用于醫療、食品、農業等領域。現有幾丁質經脫乙酰產生殼聚糖的處理方法有化學熱堿法和生物酶法：化學法存在污染嚴重、反應過程不易控制、產品分子量不穩定等問題，尤為嚴重的是排放物造成了巨大的環境污染，嚴重破壞周邊生態破壞，而生物酶法反應溫和、不破壞環境，可以制備出高質量的殼聚糖，因此生物酶法制備應用更廣泛。幾丁質脫乙酰酶（Chitin deacetylase，CDA，E.C.3.2.1.41）是一種糖基水解酶，可以通過催化作用，除去幾丁質分子結構中的乙酰基，從而形成殼聚糖。現有對于幾丁質脫乙酰酶的研究多從菌種選育、酶的純化、表達和酶學性質、發酵工藝的改良方面進行研究，上述方法在短時間內可獲得較高酶活菌株，但是受到野生菌本身產酶水平的限制，難以篩選獲得新穎的催化效率較高的幾丁質脫乙酰酶菌株，隨著酶工程尤其是定向進化技術的快速發展，為了提高酶的催化效率，本發明公開了一種海洋細菌Aspergillus nidulans（A.nidulans）幾丁質脫乙酰基酶突變體，旨在通過利用定點突變、定點飽和突變、DNA-shuffling等技術改善酶的催化特性，改變酶的最適催化溫度、最適催化pH等條件，同時提高酶的催化效率。

發明內容

本發明將海洋細菌A.nidulans幾丁質脫乙酰基酶進行了突變，相較于突變前，突變體酶的比活力是野生型酶2.95倍，大大提高了幾丁質脫乙酰基酶催化效率，更加適合工業化生產需求，其具體方案如下：

一種Aspergillus nidulans幾丁質脫乙酰基酶突變體，其特征在于：將真菌Aspergillus nidulans幾丁質脫乙酰基酶氨基酸序列進行了如下突變：139位亮氨酸（L）突變為甘氨酸（G），164位賴氨酸（K）突變為谷氨酸（E），166位酪氨酸（Y）突變為色氨酸（W），171位丙氨酸（A）突變為色氨酸（W），195位丙氨酸（A）突變為谷氨酸（E），199位組氨酸（H）突變為天冬酰胺（D），所述真菌Aspergillus nidulans幾丁質脫乙酰基酶氨基酸序列GenBank收錄號為XM_677557.1。