[發明專利]一種Arthrobacter sp. AW19M34-1幾丁質脫乙酰酶突變體

有效

• 申請號: 202010736309.2
• 申請日: 2020-07-28
• 公開（公告）號: CN111979218B
• 公開（公告）日: 2023-01-20
• 發明（設計）人: 請求不公布姓名;杭加豪;劉姝;盧靜;楊光;張春光;黃志發;劉耀東;請求不公布姓名
• 申請（專利權）人: 江蘇海洋大學
• 主分類號: C12N9/80
• 分類號: C12N9/80;C12N15/55;C12N15/70
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 嚴志平

1.一種Arthrobacter sp.AW19M34-1幾丁質脫乙酰酶突變體，其特征在于：將海洋細菌Arthrobacter sp.AW19M34-1幾丁質脫乙酰酶氨基酸序列進行了如下突變：172位賴氨酸K突變為谷氨酸E，200位谷氨酸E突變為酪氨酸Y，201位絲氨酸S突變為色氨酸W，所述Arthrobacter sp.AW19M34-1幾丁質脫乙?；竿蛔凅w的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.編碼權利要求1所述的Arthrobacter sp.AW19M34-1幾丁質脫乙酰酶突變體的基因。

3.攜帶權利要求2所述基因的質粒，所述質粒為pET21a(+)。

4.攜帶權利要求2所述基因的細胞，所述細胞為用于克隆的感受態細胞E.coli DH5α或用于表達的感受態細胞E.coli BL21（DE3）。

5.一種如權利要求1所述的Arthrobacter sp.AW19M34-1幾丁質脫乙酰酶突變體的制備方法，其特征在于：通過設計引物對編碼幾丁質脫乙酰酶的基因進行定點突變后表達，具體包括如下步驟：

（1）以野生型酶基因為模板設計引物進行突變，將突變基因與pET21a連接，形成突變后的質粒，其中野生型酶基因GenBank收錄號為LT630322.1；

（2）將突變后的質粒轉化進入E.coli DH5α進行擴增；

（3）將含有編碼突變幾丁質脫乙酰酶的基因的重組菌E.coli BL21（DE3）活化培養后發酵培養，獲取發酵菌；

（4）破碎發酵菌體，離心收集上清液，制備獲得Arthrobacter sp.AW19M34-1幾丁質脫乙酰酶突變體的粗酶液；

（5）按照His60 Ni Gravity Column Purification Kit說明書進一步純化。

6.根據權利要求5所述的一種Arthrobacter sp.AW19M34-1幾丁質脫乙酰酶突變體的制備方法，其特征在于：所述定點突變的引物如下：

ES200YW primer F：ACATTCACTATTGGAGCGTGAAGGCGGTTCCGCAG

ES200YW primer R：TTCACGCTCCAATAGTGAATGTCGTGCATCAGAATG

K172E primer F：GTTGACACGCTGGATTGGGAGCACCACGACCCACAAAAG

K172E primer R：CTTTTGTGGGTCGTGGTGCTCCCAATCCAGCGTGTCAAC。

7.根據權利要求5所述的一種Arthrobacter sp.AW19M34-1幾丁質脫乙酰酶突變體的制備方法，其特征在于：所述發酵培養具體操作為：將含有編碼突變幾丁質脫乙酰酶的基因的重組菌E.coli BL21（DE3）活化培養后接種到含有100μg/mL氨芐青霉素的發酵培養基中，接種量為1%，于37℃200r/min培養至OD600為0.6，加入終濃度0.5mM IPTG，30℃誘導發酵12h，發酵結束后在4℃、12000r/min條件下冷凍離心5min收集菌體，收集的菌體按照1g菌體用10mL 50mM Tris-HCl重懸，所述Tris-HCl的pH 為8.0，并以超聲波細胞粉碎儀破碎菌體，在4℃、12000r/min條件下冷凍離心5min，收集上清液作為粗酶液。

8.根據權利要求7所述的一種Arthrobacter sp.AW19M34-1幾丁質脫乙酰酶突變體的制備方法，其特征在于：所述超聲波細胞粉碎儀共超聲5min，每超聲5s暫停5s。

9.根據權利要求7所述的一種Arthrobacter sp.AW19M34-1幾丁質脫乙酰酶突變體的制備方法，其特征在于：所述氨芐青霉素的發酵培養基組成包括胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，培養基pH7.0。