[發(fā)明專利]重組酶擴(kuò)增結(jié)合免疫側(cè)流向檢測新冠病毒的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010731921.0
• 申請日: 2020-07-27
• 公開（公告）號: CN111793719A
• 公開（公告）日: 2020-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林敏;鄭玉忠;楊培奎;林麗云;陳江濤;吳顯勁
• 申請（專利權(quán)）人: 韓山師范學(xué)院;惠州市中心人民醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12Q1/6804;C12R1/93
• 代理公司: 北京勁創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11589
• 代理人: 徐家升

1.重組酶擴(kuò)增結(jié)合免疫側(cè)流向檢測新冠病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：制備新冠病毒COVID-19檢驗(yàn)樣品比對盤；

S2：確定樣品檢測方式和相應(yīng)檢測體系；

S3：確定及優(yōu)化核酸試紙條靈敏度；

S4：試驗(yàn)結(jié)果分析；

S5：由試驗(yàn)結(jié)果分析引物組合2測序結(jié)果與COVID-19 N基因的比對結(jié)果；

S6：研究分析引物對組合2敏感性及特異性；

S7：進(jìn)行引物對組合2RT RAA擴(kuò)增精密性和重復(fù)性試驗(yàn)。

2.如權(quán)利要求1所述的重組酶擴(kuò)增結(jié)合免疫側(cè)流向檢測新冠病毒的方法，其特征在于，S1中具體方法為：

2.7μg新冠病毒COVID-19 N基因全序列的重組質(zhì)粒COVID-19 N pBluescript IISK(+)購自上海生工，以紫外分光光度計(jì)測量重組質(zhì)粒OD₂₆₀、OD₂₈₀及OD₂₆₀/OD₂₈₀值，并重復(fù)3次，確定質(zhì)粒DNA濃度和純度，再按照公式獲得質(zhì)粒的拷貝數(shù)：

拷貝數(shù)＝質(zhì)粒濃度×6.02×10²³/(660×質(zhì)粒總長度)

計(jì)算拷貝數(shù)并稀釋至1×10⁸拷貝/μL，–20℃保存?zhèn)溆?/p>

以1×10⁶拷貝/μL作為比對盤原液，進(jìn)行10^-1×比對盤原液樣本，10^-2×比對盤原液樣本，10^-3×比對盤原液樣本，10^-4×比對盤原液樣本，10^-5×比對盤原液和10^-6×比對盤原液樣本梯度稀釋對比；將已定值的重組質(zhì)粒稀釋至1×10⁵拷貝/μL，再10倍系列稀釋，獲得1×10⁰拷貝/μL、1×10¹拷貝/μL、1×10²拷貝/μL、1×10³拷貝/μL、1×10⁴拷貝/μL和1×10⁵拷貝/μL稀釋液為后續(xù)擴(kuò)增模板。

3.如權(quán)利要求1所述的重組酶擴(kuò)增結(jié)合免疫側(cè)流向檢測新冠病毒的方法，其特征在于，S2中的具體方法如下：

S201：新冠病毒的N基因RAA擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)：以新冠病毒COVID-19N基因作為靶基因，分析新冠病毒COVID-19N基因的序列特點(diǎn)后，應(yīng)用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)種屬特異性擴(kuò)增引物，探針序列位于擴(kuò)增引物中間區(qū)段，經(jīng)四氫呋喃修飾；引物設(shè)計(jì)遵循以下原則：①擴(kuò)增引物長度20-30bp，不同引物的PCR退火溫度盡可能一致或相似；②擴(kuò)增產(chǎn)物長度200-500bp，具物種特異性；③探針長度為45-60bp；使用美國國家生物技術(shù)信息中心的BLAST功能對引物擴(kuò)增區(qū)段序列進(jìn)行比對，完成引物擴(kuò)增特異性的初步鑒定；

S202：RAA核酸擴(kuò)增的電泳檢測：使用Tiosbio RT RAA核酸擴(kuò)增試劑盒JY0203進(jìn)行RAA反應(yīng)體系的配制，吸取10μL的DNA純化產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測；

S203：RAA核酸擴(kuò)增試紙條檢測：使用Tiosbio RT RAA核酸擴(kuò)增試劑盒試紙條法JY0204進(jìn)行RAA反應(yīng)體系的配制，將試紙條的浸液區(qū)端插入eppendorf管，根據(jù)試紙條顯色情況直接讀取檢測結(jié)果。

4.如權(quán)利要求1所述的重組酶擴(kuò)增結(jié)合免疫側(cè)流向檢測新冠病毒的方法，其特征在于，S3中的具體方法如下：以檢測時間最短的試驗(yàn)條件為最適條件，在S2的基礎(chǔ)上對擴(kuò)增體系進(jìn)行調(diào)整，通過比較RAA核酸擴(kuò)增試紙條檢測體系使用的MgAc₂添加量、不同的上游引物添加量、反應(yīng)時間的多個因素，確定最佳的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

5.如權(quán)利要求1所述的重組酶擴(kuò)增結(jié)合免疫側(cè)流向檢測新冠病毒的方法，其特征在于，S5中的具體方法如下：對引物組合2上游引物、下游引物擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆測序結(jié)果顯示，該引物對測序結(jié)果與通用公司提供的質(zhì)粒測序結(jié)果完全一致，顯示引物組合2可以進(jìn)行特異性擴(kuò)增。