[發(fā)明專利]一種適用于低鈣離子濃度的纖維小體對接蛋白組合突變體36865及應(yīng)用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010730617.4 | 申請日： | 2020-07-27 |
| 公開（公告）號： | CN111850006B | 公開（公告）日： | 2022-04-22 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 汪俊卿;姜彥君;李楠;薛樂;范翰;王瑞明;田文卓;楊翠平;王大濤;王子睿 | 申請（專利權(quán)）人： | 齊魯工業(yè)大學(xué) |
| 主分類號： | C12N15/31 | 分類號： | C12N15/31;C07K14/33;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C12N15/70;C12N15/10 |
| 代理公司： | 濟(jì)南竹森知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 37270 | 代理人： | 朱家富 |
| 地址： | 250300 山東*** | 國省代碼： | 山東;37 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 適用于 離子 濃度 纖維 小體 對接 蛋白 組合 突變體 36865 應(yīng)用 | ||
1.一種適用于低鈣離子濃度的纖維小體對接蛋白組合突變體36865，其特征在于，一種纖維小體對接蛋白DocA，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得適用于低鈣離子濃度的對接蛋白組合突變體36865，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一種適用于低鈣離子濃度的纖維小體對接蛋白組合突變體36865，其特征在于，一種纖維小體對接蛋白DocA，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得適用于低鈣離子濃度的對接蛋白組合突變體36865，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述突變體36865的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
以所述對接蛋白中的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得對接蛋白組合突變體36865，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變引物，以攜帶纖維小體對接蛋白基因的pET28a(+)載體為模板，進(jìn)行PCR，構(gòu)建重組突變質(zhì)粒，并將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，挑選陽性克隆進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后收集菌體，對菌體進(jìn)行破碎，純化獲得纖維小體對接蛋白突變體。
4.如權(quán)利要求3所述突變體36865的制備方法，其特征在于，所述制備方法中，由對接蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，突變?yōu)閷拥鞍捉M合突變體36865，氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
5.如權(quán)利要求3所述突變體36865的制備方法，其特征在于，發(fā)酵結(jié)束后離心收集菌體，對菌體進(jìn)行超聲破碎，經(jīng)親和色譜純化獲得纖維小體對接蛋白突變體。
6.如權(quán)利要求3所述突變體36865的制備方法，其特征在于，對接蛋白組合突變體36865的PCR擴(kuò)增，將質(zhì)粒分為AB段和BA段，AB段擴(kuò)增引物為 SEQ ID NO.9和 SEQ ID NO.12，BA段擴(kuò)增引物為SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11，使用所述擴(kuò)增引物分別對AB段和BA段進(jìn)行擴(kuò)增。
7.如權(quán)利要求6所述突變體36865的制備方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系：
質(zhì)粒DocA-pET28a載體模板1 μL，正向突變引物F1/F2 2μL，反向突變引物R2/R1 2μL，2× Max Buffer25μL，dNTP 4 μL，DNA Polymerase 1 μL，ddH2O15 μL。
8.如權(quán)利要求7所述突變體36865的制備方法，其特征在于，所述制備方法中，PCR反應(yīng)條件：
95℃預(yù)變性3min；95℃ 15sec，60℃ 15sec，72℃ 3min，18個循環(huán)；補(bǔ)充延伸72℃7min。
9.如權(quán)利要求6所述突變體36865的制備方法，其特征在于，PCR反應(yīng)完成后，需要用
10.如權(quán)利要求9所述突變體36865的制備方法，其特征在于，所述消化體系：
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物40μL，
11.如權(quán)利要求6所述突變體36865的制備方法，其特征在于，將消化產(chǎn)物進(jìn)行DNA凝膠電泳檢測，檢測后分別將AB段與BA段利用膠回收試劑盒進(jìn)行回收。
12.如權(quán)利要求11所述突變體36865的制備方法，其特征在于，將回收后的AB段與BA段利用Exnase II進(jìn)行重組，反應(yīng)產(chǎn)物為待轉(zhuǎn)化載體，重組反應(yīng)體系如下：
ddH2O 10 μL，5× CE II Buffer 4 μL，AB段回收產(chǎn)物 2 μL，BA段回收產(chǎn)物 2 μL，Exnase II 2 μL。
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