[發(fā)明專利]一種梨果實石細胞特異性組織化學定位的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010729922.1
• 申請日: 2020-07-27
• 公開（公告）號: CN111855360B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發(fā)明（設計）人: 蔡永萍;章?lián)P;程曦;金青;黃滿暢;魯津津
• 申請（專利權）人: 安徽農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N1/31;G01N21/84
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 董大媛

本發(fā)明提供了一種梨果實石細胞特異性組織化學定位的方法，屬于細胞染色技術領域，包括：將梨果實在維生素C溶液中切片，得到梨果實片；將梨果實片淹沒在染色反應溶液中2～5h，得到浸泡梨果實片；所述染色反應溶液的組分包括二氨基聯(lián)苯胺或硝基四氮唑；將浸泡梨果實片脫色劑脫色后，經(jīng)固定液封片。本發(fā)明區(qū)分度高，能準確、方便、有效的區(qū)分梨果肉薄壁細胞和石細胞。安全系數(shù)高，不涉及危化品，沒有刺激性氣味。維生素C有效地減輕切片的褐化現(xiàn)象，防止顯色顏色干擾。能夠高效觀察石細胞發(fā)育過程形態(tài)結構特征并可區(qū)分石細胞含量及大小不同梨品種。

技術領域

本發(fā)明屬于細胞染色技術領域，尤其涉及一種梨果實石細胞特異性組織化學定位的方法。

背景技術

梨是我國重要落葉果樹之一，栽培歷史悠久、分布廣泛、資源豐富。石細胞是木質素在梨果實薄壁細胞的細胞壁上沉積引起細胞壁發(fā)生次生加厚而形成的，梨石細胞的含量是梨果實品質的一個決定性因素。因此，研究梨石細胞的形態(tài)、分布及組織定位意義重大。

前期研究表明，梨石細胞形成過程是一個細胞程序性死亡的過程，細胞發(fā)生凋亡的時期與活性氧的積累密切相關，而活性氧在木質素聚合和沉積過程中起關鍵作用。植物NADPH氧化酶，又稱呼吸爆發(fā)氧化酶(RBOH)，它催化O₂和NADPH產(chǎn)生O₂^-、NADP⁺和H⁺，隨后O₂^-可作為超氧化物歧化酶(SOD)的底物催化生成H₂O₂和O₂。H₂O₂和O₂分別作為過氧化物酶(POD)和漆酶(LAC)的第二底物參與木質素單體聚合。最后，POD和LAC活化木質素單體自由基，使其聚合形成木質素。由此推測，活性氧在梨果實中可能僅在石細胞中大量積累,通過對活性氧進行染色，從而對石細胞進行定位。

目前常規(guī)的Wiesner法都只是對木質素進行染色，這使石細胞以及果皮、果肉、果核、果柄等部位的木質素都會被染色，造成背景干擾。這種染色方法，不但容易褪色、成本高，而且使用的試劑如：濃鹽酸、濃氨水、高錳酸鉀等都屬于危化品，一旦吸入對呼吸道等部位損害嚴重，不小心接觸到會灼傷皮膚，腐蝕皮膚，而且強酸強堿也會加速梨果肉褐化。因此，需要一種準確、簡便、快速、安全、特異性強的方法定位梨果實石細胞。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種梨果實石細胞特異性組織化學定位的方法。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術方案：

本發(fā)明提供了一種梨果實石細胞特異性組織化學定位的方法，包括以下步驟：

1)將梨果實在維生素C溶液中切片，得到梨果實片；

2)將所述步驟1)得到的梨果實片淹沒在染色反應溶液中2～5h，得到浸泡梨果實片；

所述染色反應溶液的組分包括二氨基聯(lián)苯胺或硝基四氮唑；

3)將所述步驟2)得到的浸泡梨果實片脫色劑脫色后，經(jīng)固定液封片。

優(yōu)選的，所述步驟2)染色反應溶液中二氨基聯(lián)苯胺的濃度為0.4～0.6g/L。

優(yōu)選的，所述步驟2)染色反應溶液中硝基四氮唑的濃度為0.4～0.6g/L。

優(yōu)選的，所述步驟2)浸泡在避光條件下進行。

優(yōu)選的，所述步驟1)維生素C溶液中維生素C的濃度為0.04～0.06g/L。

優(yōu)選的，所述步驟1)梨果實片的厚度為2～4cm。