[發明專利]PCR擴增用試劑的凍干保護劑、制品及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 202010728670.0
• 申請日: 2020-07-24
• 公開（公告）號: CN111826427B
• 公開（公告）日: 2023-09-26
• 發明（設計）人: 歐格;鄧京;何綺婷;勾宏娜
• 申請（專利權）人: 珠海麗珠試劑股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 北京超成律師事務所 11646
• 代理人: 高玉光

本發明涉及生物技術領域，具體而言，提供了一種PCR擴增用試劑的凍干保護劑、制品及其制備方法與應用。本發明提供的PCR擴增用試劑的凍干保護劑，包括海藻糖、羥丙基?β?環糊精、菊糖和卡拉膠。該凍干保護劑可以顯著延長PCR擴增用試劑的有效期，同時能夠有效降低PCR擴增反應體系在使用時形成氣溶膠的可能，提高PCR的靈敏度和準確性。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體而言，涉及一種PCR擴增用試劑的凍干保護劑、制品及其制備方法與應用。

背景技術

聚合酶鏈式反應(Polymerase?Chain?Reaction，PCR)是一種體外控制核酸技術，其在合適的緩沖體系中，在有特異性引物、脫氧核糖核酸，合適的聚合酶以及陽離子存在的條件下，經過變性-復性-延伸的反復循環，在短時間內獲得大量特定基因片段的方法。

由于PCR體系中很多組分，尤其是酶、引物探針和dNTPs等對溫度均較為敏感，熒光PCR試劑在使用、保存和運輸條件上要求非常苛刻。目前應用較多PCR擴增用試劑呈液體狀態，穩定性較差，易失效，在2-8℃條件下保存的有效期也只有3個月左右。近年來，有不少研究者對PCR體系進行冷凍干燥處理，但由于凍干技術和冷凍干燥過程對酶的影響(如穩定性)，結果鮮有成效。并且，很多配方凍干后較難復溶，給用戶使用帶來了極大的不便。

在現有的藥物凍干技術中，常用的凍干保護劑中作為支撐作用的輔料有糖和醇類、聚合物和氨基酸等，例如甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、蔗糖、明膠、藻酸鹽、環糊精等。這些填料，雖在藥品凍干中應用廣泛，但PCR試劑對填料的要求與藥物對填料的要求有明顯不同：比如藥物要求的是對身體的無害(比如無致死、致畸和致突變等)，而PCR試劑對填料的要求更注重的是對檢測反應無影響(靈敏度、特異性、效期)，例如不能引進對反應有抑制的物質如陽離子、反應競爭物或抑制劑等。因此，填料在藥物和PCR體系中的應用場景存在非常大的不同。

對于PCR體系的凍干，首先需要在冷凍干燥過程保持酶、dNTP和引物探針的活性，其次應考慮到填料的玻璃化轉變溫度(Tg’)對冷凍干燥溫度條件的限制，以及保護劑的吸濕性帶來的效期縮短。

有資料推測雙糖的羥基能在蛋白質脫水過程中與其氫鍵連接及時形成水化膜，從而保護了生物大分子的高級結構及功能完整。因此糖類尤其是海藻糖和蔗糖在PCR體系的凍干中較為常見，但蔗糖容易在PCR反應的高溫變性中發生美德拉反應而對檢測結果造成影響，一般會導致試劑的靈敏度和均一性變差。而海藻糖有結合水，并且極易吸濕，在保存過程中凍干粉吸潮會直接影響凍干試劑的效期，而凍干試劑的穩定性，跟凍干粉殘留的水分息息相關，水分越多，穩定性越差，因此單純使用海藻糖，試劑的穩定性不會是最優的。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的第一目的在于提供一種PCR擴增用試劑的凍干保護劑。

本發明的第二目的在于提供一種凍干PCR擴增用試劑的制備方法。

本發明的第三目的在于提供上述制備方法制備得到的凍干PCR擴增用試劑。

本發明的第四目的在于提供凍干PCR擴增用試劑的應用。

為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：

一種PCR擴增用試劑的凍干保護劑，包括海藻糖、羥丙基-β-環糊精、菊糖和卡拉膠。

進一步地，包括2-6w/v％海藻糖、0.4-2w/v％羥丙基-β-環糊精、0.05-0.20w/v％菊糖和0.005-0.020w/v％卡拉膠。

進一步地，包括4w/v％海藻糖、1w/v％羥丙基-β-環糊精、0.1w/v％菊糖和0.010w/v％卡拉膠。

進一步地，所述PCR擴增用試劑包括酶、RNA酶抑制劑、dNTPS、引物、探針和緩沖液中的至少一種。