[發(fā)明專利]用于宮頸癌檢測的DNA甲基化qPCR試劑盒及其使用方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010728221.6 | 申請日： | 2020-07-23 |
| 公開（公告）號： | CN111793690A | 公開（公告）日： | 2020-10-20 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 王志強;萬季;潘曉新;夏迪;金泰慶;蔡雪兒;羅海燕;王一杏;關(guān)建洪;王奕;宋麒 | 申請（專利權(quán)）人： | 深圳市新合生物醫(yī)療科技有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/6886 | 分類號： | C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京冠和權(quán)律師事務(wù)所 11399 | 代理人： | 朱健 |
| 地址： | 518055 廣東省深圳市南*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 用于 宮頸癌 檢測 dna 甲基化 qpcr 試劑盒 及其 使用方法 | ||
1.用于宮頸癌檢測的DNA甲基化qPCR試劑盒，通過檢測或測量受試樣品DNA中一種或多種特定基因的甲基化狀態(tài)或水平來篩查和診斷宮頸癌，所述試劑盒包括檢測或測量受試樣品DNA中一種或多種特定基因的甲基化狀態(tài)或水平的特異性引物和探針，所述特定基因包括JAM3和ACTB。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，用于檢測JAM3基因甲基化狀態(tài)的特異性引物和探針選自下述三種特異性引物和探針組合中的任一種：特異性引物SEQ ID NO:1-2和探針SEQ ID NO:3、特異性引物SEQ ID NO:4-5和探針SEQ ID NO:6、特異性引物SEQ IDNO:7-8和探針SEQ ID NO:9。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，用于檢測ACTB基因甲基化狀態(tài)的特異性引物和探針為特異性引物SEQ ID NO:10-11和探針SEQ ID NO:12。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的試劑盒，其特征在于，所述特異性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11均經(jīng)過硫代磷酸酯修飾，且在嚴格條件下與甲基化或非甲基化的目標基因區(qū)域雜交；
和/或，所述探針SEQ ID NO:3、6、9、12是基于TaqManTM設(shè)計的，且在嚴格條件下與甲基化或非甲基化的目標基因區(qū)域雜交。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的試劑盒，其特征在于，JAM3基因探針SEQ ID NO:3、6、9核苷酸序列5’端標記Cy5，3’端標記QSY；ACTB基因探針SEQ ID NO:12核苷酸序列5’端標記VIC，3’端標記MGBNFQ；
和/或，所述特異性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11和所述探針SEQ ID NO:3、6、9、12的長度為10-50nt；
和/或，所述試劑盒中還包含下述組成部分：dNTP混合溶液、MgCl2溶液、DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液、PCR去離子水；
和/或，所述試劑盒中還包含下述組成部分：組織基因組DNA提取試劑和DNA甲基化轉(zhuǎn)化試劑，優(yōu)選地，所述宮頸細胞DNA甲基化轉(zhuǎn)化試劑為亞硫酸氫鹽；
和/或，所述受試樣品DNA為完整基因組、無細胞DNA或循環(huán)腫瘤DNA。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的試劑盒的使用方法，包括以下步驟：
(1)宮頸細胞中的DNA提取：利用組織DNA提取試劑從待測樣本中提取宮頸細胞中的DNA；
(2)DNA甲基化轉(zhuǎn)化：利用DNA甲基化轉(zhuǎn)化試劑對提取的宮頸細胞中的DNA進行亞硫酸氫鹽處理并隨后進行純化；
(3)將進行甲基化轉(zhuǎn)化并純化的血漿游離DNA進行熒光定量PCR擴增，PCR反應(yīng)結(jié)束后，將Ct閾值設(shè)定在線性擴增區(qū)間，Ct值小于40的擴增認定為陽性；
(4)結(jié)果判定：當內(nèi)部參照位點ACTB檢測結(jié)果陽性，靶點JAM3的三個重復(fù)擴增中至少兩個為陽性則確定為該靶點結(jié)果陽性；
優(yōu)選地，所述第(3)步驟中，每個模板的PCR擴增做三個重復(fù)；
優(yōu)選地，所述第(3)步驟中，選用下述方法中的任一種：甲基化特異性定量PCR、實時甲基化特異性PCR、使用甲基化DNA特異性結(jié)合蛋白的PCR。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，每個反應(yīng)體系10μL，其中含(0.5-1.5μL)1xPCR反應(yīng)緩沖液、200-400μm dNTPs、3-6mM MgCl2、1-3U AmpliTaq Gold DNA聚合酶、30-60nM ROX染料。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，JAM3基因區(qū)域靶點的引物各300-500nM，JAM3基因區(qū)域靶點的探針各200-300nM；
和/或，ACTB基因區(qū)域靶點的引物150-250nM，ACTB基因區(qū)域靶點的探針50-150nM。
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