[發明專利]一種用于檢測甘薯黑斑病菌的LFD-RPA可視化檢測引物組及檢測方法

在審

• 申請號: 202010727884.6
• 申請日: 2020-07-23
• 公開（公告）號: CN111705158A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 王榮波;陳慶河;劉裴清;李本金;翁啟勇
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發明公開了一種用于檢測甘薯黑斑病菌的LFD?RPA可視化檢測引物組及檢測方法，屬于農作物病害檢測、鑒定及防治技術領域。包括基于LFD?RPA的可視化檢測引物組：2條引物CfRPAF和CfLFD?RPAR，以及1條探針CfLF?Probe；并公開了檢測方法和應用。本發明提供的檢測引物組具有特異性強、結果可靠、靈敏度高、實用性好、操作簡便快速的優勢，結果肉眼直接可見，可以真正實現便捷式的現場快速檢測。

技術領域

本發明涉及農作物病害檢測、鑒定及防治技術領域，更具體的說是涉及一種用于檢測甘薯黑斑病菌的LFD-RPA可視化檢測引物組及檢測方法。

背景技術

甘薯是我國主要的糧食作物之一，也是重要性輕工業原料和飼料作物。我國甘薯消費的形式除了加工淀粉、酒精外，鮮食用、葉菜用比例有所增加，國家發改委已將甘薯選定為燃料乙醇生產的首選非糧原料作物。甘薯作為新型能源作物，在保障國家糧食安全和能源安全中占有重要的地位。中國是世界上最大的甘薯生產國，每年種植面積約500萬公頃，約占世界的53.5％；年生產量約1.1萬噸，約占世界的82.2％。

甘薯黑斑病(sweep potato black rot)是甘薯栽培和貯藏中十分常見和危害十分嚴重的病害，又名黑疤病，在世界各甘薯產區均有發生，是甘薯生產上嚴重影響產量的三大病害之一。據統計，我國每年由該病造成約5％-10％的甘薯損失，嚴重時甚至可以達到20％-50％或更高的損失。其病原菌為甘薯長喙殼菌(Ceratocystis fimbriata Ellis etHalsted)，該菌分布廣泛、種群分化復雜，主要危害幼苗莖基部及塊根組織，引起死苗、爛床、爛窖，對甘薯生產影響極大。甘薯品種間黑斑病抗性差異明顯，高抗品種較少，而且在高抗的品種中，兼具高產、高干率的品種尚未發現，成為疫區產量提高的主要限制性因素之一。帶有黑斑病菌的病薯內可產生甘薯黑皰霉酮(ipomeamarone)等呋喃萜類有毒物質，家畜食用后可引起中毒癥狀，此外，用病薯作發酵原料會毒害酵母菌和糖化酶菌，延緩發酵過程，降低酒精產量和質量，嚴重制約甘薯產業的發展。因此，研發出甘薯黑斑病的早期快速診斷方法并進行及時監測，對保障甘薯健康生產及食品安全至關重要。

傳統的病害檢測技術需要對病原菌進行分離培養，根據病原菌菌落的大小、形狀、生物學特性等進行鑒定，耗時耗力，病害診斷需要積累豐富的實踐經驗，且一些病原真菌的外部形態特征十分復雜，既具相似性，又存在不穩定性，使檢測難度大大增加。常規PCR、巢式PCR、LAMP和實時熒光定量PCR等分子技術已經應用于甘薯黑斑病菌的檢測。但是，常規PCR、巢式PCR及實時熒光定量PCR檢測技術需要專業儀器并由分子生物學專業實驗人員操作，檢測時間長，操作復雜。循環恒溫擴增技術(Loop-mediated isothermalamplification，簡稱LAMP)需針對靶基因的6個位點設計出4條引物，并且在較高的恒溫條件下(60～65℃)保溫30～90分鐘進行反應，引物設計復雜，且易出現假陽性。

重組酶聚合酶擴增(Recombinase ploymerase amplification,RPA)技術是在重組酶介導下模擬體內DNA的復制過程。重組酶與引物結合形成蛋白-DNA復合物后，尋找并定位雙鏈DNA同源序列，從而實現對模板上目標區域的指數擴增。它與PCR不同，不需要退火反應過程，可在37℃～42℃等溫條件下，反應20min左右即可得到擴增產物。RPA可以與側向流動層析技術相結合，在RPA擴增體系中，需要生物素標記的反向引物和熒光基團標記的探針，在距熒光基團30個堿基處有一個脫堿基位點(dSpacer)，該位點可被nfo核酶識別、切割，產生新的羥基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成帶有生物素和熒光基團雙標記的RPA產物，通過層析膜擴散，被生物素配體和熒光基團標記抗體捕獲，形成具有顏色的檢測線。該方法檢測時間短，5min左右就能目測結果，肉眼判讀。

重組酶聚合酶核酸擴增技術(RPA)對樣本要求低，可在25～45℃下15min內將痕量核酸模板擴增到可檢測水平，與側流層析試紙條(lateral flow dipstick，LFD)結合應用形成的LFD-RPA體系能實現肉眼直接判定結果，因而具有極為廣泛的應用前景。