[發(fā)明專利]一種用于新型冠狀病毒微滴式數(shù)字PCR檢測的試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010726713.1
• 申請(qǐng)日: 2020-07-25
• 公開（公告）號(hào): CN111926115A
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王德貴;王芳;午馬;謝坤;沈蓉;宋焱峰;劉向文
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘭州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責(zé)任公司 62102
• 代理人: 張晉

本發(fā)明公開一種用于新型冠狀病毒檢測的試劑盒。本發(fā)明的對(duì)微滴式數(shù)字PCR技術(shù)的檢測試劑盒，其試劑盒內(nèi)至少有兩條序列分別為SEQ ID No.1、SEQ ID No.2的擴(kuò)增引物和一條序列為SEQ ID No.3的探針。本發(fā)明利用COVID?19基因序列中N基因組設(shè)計(jì)了特異性引物和探針，并將其用于微滴式數(shù)字PCR技術(shù)(ddPCR)，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其可行性和特異性。本發(fā)明的試劑盒可作為新冠病毒檢測的補(bǔ)充，并具有更高的檢測靈敏度性和特異性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于病毒檢測的試劑盒，特別是一種用于新型冠狀病毒檢測的試劑盒。

背景技術(shù)

傳染病疫情會(huì)對(duì)全球公共衛(wèi)生形成重大沖擊，并對(duì)人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響，對(duì)人群進(jìn)行傳染病毒檢測是疫情的防治中的首要任務(wù)，如對(duì)新冠病毒隨著疫情的變化以及流行病學(xué)調(diào)研的推進(jìn)，需要在高鐵，車站，飛機(jī)等人員密集區(qū)進(jìn)行環(huán)境采集樣品，如空氣顆粒、水樣的監(jiān)測也需要進(jìn)行檢測。目前新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的檢測主要依靠熒光定量PCR進(jìn)行檢測，但靈敏度不高。有些患者已經(jīng)出現(xiàn)癥狀，病毒檢測仍然呈陰性。但由于病毒核酸含量低，普通PCR難以高效檢出，并易產(chǎn)生假陰性的問題。如果新型冠狀病毒發(fā)生變異，病毒基因序列上引物、探針靶向位置出現(xiàn)SNV（單核苷酸突變）會(huì)使檢出產(chǎn)生更大的困難。此外，在臨床檢測中，由于送檢樣本來自不同地區(qū)，不同的樣本，提取核酸后可能存在對(duì)PCR擴(kuò)增的抑制因子如肝素等。這些PCR抑制劑的存在，對(duì)qPCR檢測結(jié)果也會(huì)有一定干擾，影響檢測的結(jié)果。

在目前COVID-19疫情嚴(yán)峻的形式下，尋找一種可快速，準(zhǔn)確，高效，靈敏診斷病例，進(jìn)一步降低假陰性率，提高檢測的靈敏度的檢測方法對(duì)切斷傳染源，是當(dāng)務(wù)之急。

新型冠狀病毒的檢測方法主要包含核酸檢測、抗體檢測、抗原檢測幾種方法。抗原檢測檢出率較低，所以基本上不采用。

抗體檢測：病毒侵入人體后，人體會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行防御。最早出現(xiàn)的抗體種類是IgM，但該抗體維持時(shí)間短、濃度低、親和力較低，在血中持續(xù)數(shù)日至數(shù)周，是急性期感染的診斷指標(biāo)；在IgM接近消失時(shí)，IgG的含量達(dá)到高峰，IgG產(chǎn)生晚，但濃度高、維持時(shí)間長、親和力高。研究者通過對(duì) COVID-19患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，病毒侵入人體后，IgM抗體大約需要5-7天產(chǎn)生， IgG抗體在10-15天時(shí)產(chǎn)生。抗體檢測操作便捷、檢測迅速，可作為核酸診斷的補(bǔ)充手段，但由于抗體出現(xiàn)較晚，不能檢測到處于窗口期的患者。同時(shí)，由于抗體檢測存在較高的“假陽性”和“假陰性”，不適合用于復(fù)工復(fù)產(chǎn)復(fù)學(xué)等普通人群篩查，也不適用于在低流行地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查。

核酸檢測目前是新型冠狀病毒檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，具有早期診斷、靈敏度和特異性高等特點(diǎn)。由于新型冠狀病毒是RNA病毒，本發(fā)明的試劑盒是采用一步法反轉(zhuǎn)錄加實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR)，擴(kuò)增病原體的核酸(RNA)，同時(shí)通過熒光探針實(shí)時(shí)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。在PCR反應(yīng)體系中，包含一對(duì)特異性引物以及一個(gè)Taqman探針，該探針為一段特異性寡核苷酸序列，兩端分別標(biāo)記了報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，不發(fā)光；如反應(yīng)體系存在靶序列，PCR反應(yīng)時(shí)探針與模板結(jié)合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針酶切降解，報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出熒光，從而檢測到信號(hào)，所以特異性高。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子產(chǎn)生。熒光定量PCR儀能夠檢測出熒光到達(dá)預(yù)先設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)(Ct 值)與病毒核酸濃度有關(guān)，病毒核酸濃度越高，Ct值越小。